[发明专利]一种AFP-IgM检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种AFP-IgM检测试剂盒及检测方法。

背景技术

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是常见的恶性肿瘤之一，每年在世界范围内约有100万新发的病例。其主要诱因为乙型(中国与东南亚地区)和丙型(欧洲)肝炎病毒，早期缺乏典型的临床表现、恶性程度高，难以早期诊断，且预后较差。

甲胎蛋白(AFP)在肝癌病人体内以两种形式存在：即游离AFP(fAFP)和循环IgM复合型AFP(AFP-IgM IC)。游离AFP又根据对植物凝集素(lectin)亲和力的不同分为：AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3三个亚型，其中AFP-L3可作为衡量肝癌细胞恶性程度的一个标志物。AFP作为诊断HCC的首选肿瘤标志物，在肝癌的诊断方面占据着主要的地位，自应用于临床以来使HCC诊断的准确性得到较大的提高，文献报道其敏感性为41％～65％，但也易受如慢性肝炎、肝硬化与妊娠等其他因素影响。对于早期HCC的诊断，AFP假阴性率可达40％以上，进展期AFP的假阴性率为15％～20％，如何提高肝癌临床检出率是提高其生存率的关键因素。

AFP-IgM复合物是近年发现的新型肝癌标志物，AFP-IgM与AFP之间存在很好的互补性。游离AFP和循环IgM复合型AFP不会发生交迭，AFP-IgM是一种补充血清标志物，两类标志物的联合检测有助于肝癌的诊断。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提高肝癌检出率。为此本发明提供了一种AFP-IgM检测试剂盒及检测方法，使用该试剂盒同时联合现有AFP检测技术能提高肝癌诊断准确度。

本发明提供了一种检测患者体内AFP-IgM含量的试剂盒，包括下列试剂：作为标准品的人免疫球蛋白IgM、作为标准品包被抗体的抗IgM抗体、作为检测样品包被抗体的抗AFP抗体、作为酶标记检测抗体的抗IgM辣根过氧化物酶标记物(IgM-HRP)、作为显色剂的四甲基联苯胺溶液(TMB)、作为终止液的2M H₂SO₄溶液、包被缓冲液、洗涤缓冲液、稀释缓冲液。

作为优选，标准品包被抗体IgM抗体为羊抗人IgM多克隆抗体，0.2μg/ml，0.3ml。

作为优选，检测样品包被抗体抗AFP抗体为鼠抗人AFP单克隆抗体，0.2μg/ml，0.3ml。

作为优选，抗IgM辣根过氧化物酶标记物为兔抗人辣根过氧化物酶标记物，0.5mg/L，0.1ml。

作为优选，包被缓冲液为PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液。该缓冲液可由Na₂CO₃ 1.59克NaHCO₃2.93克，加蒸馏水至1000ml，调PH至9.6制得。

作为优选，洗涤缓冲液为PH7.40.15M磷酸盐缓冲溶液。该溶液可由KH₂PO₄ 0.2克、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9克、NaCl 8.0克、KCl 0.2克、0.05％Tween-20 0.5ml、加蒸馏水至1000ml，调PH至7.4制得。

作为优选，稀释缓冲液为牛血清白蛋白(BSA)与洗涤缓冲溶液配成质量分数0.1％(g/ml)使用或以羊血清、兔血清血清与洗涤缓冲溶液配成质量分数5～10％(g/ml)使用。

作为优选，四甲基联苯胺溶液可由2mg/ml四甲基联苯胺无水乙醇溶液0.5ml、PH5.0底物缓冲液10ml、0.75％H₂O₂ 32μl制得，其中PH5.0底物缓冲液可由0.2M Na₂HPO₄25.7ml、0.1M柠檬酸24.3ml，加蒸馏水50ml制得。

本发明提供了一种使用上述试剂盒检测患者体内体内AFP-IgM含量的方法，具体方法是：

第一步：包被

(2)标准品孔用IgM抗体包被于酶标板孔内；

(2)检测孔用AFP抗体包被于酶标板孔内；

第二步：洗涤酶标板孔，移去包被液；