[发明专利]一种AFP-IgM检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种检测患者体内AFP-IgM含量的试剂盒，包括下列试剂：作为标准品的人免疫球蛋白IgM、作为标准品包被抗体的抗IgM抗体、作为检测样品包被抗体的抗AFP抗体、作为酶标记检测抗体的抗IgM辣根过氧化物酶标记物、作为显色剂的四甲基联苯胺溶液、作为终止液的2M H₂SO₄溶液、包被缓冲液、洗涤缓冲液、稀释缓冲液。

2.权利要求1所述的试剂盒，特征在于标准品包被抗体IgM抗体为羊抗人IgM多克隆抗体，0.2μg/ml，0.3ml。

3.权利要求1所述的试剂盒，特征在于检测样品包被抗体抗AFP抗体为鼠抗人AFP单克隆抗体，0.2μg/ml，0.3ml。

4.权利要求1所述的试剂盒，特征在于抗IgM辣根过氧化物酶标记物为兔抗人辣根过氧化物酶标记物，0.5mg/L，0.1ml。

5.权利要求1所述的试剂盒，特征在于包被缓冲液为PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液。

6.权利要求1所述的试剂盒，特征在于洗涤缓冲液为PH7.4 0.15M磷酸盐缓冲溶液。

7.权利要求1所述的试剂盒，特征在于稀释缓冲液为牛血清白蛋白与洗涤缓冲液配成质量分数0.1％使用或以羊血清、兔血清与洗涤缓冲溶液配成质量分数5～10％使用。

8.权利要求1所述的试剂盒，特征在于四甲基联苯胺溶液由2mg/ml四甲基联苯胺无水乙醇溶液0.5ml、PH5.0底物缓冲液10ml、0.75％H₂O₂ 32μl制得，其中PH5.0底物缓冲液由0.2M Na₂HPO₄ 25.7ml、0.1M柠檬酸24.3ml，加蒸馏水50ml制得。

9.权利要求1-8任一项试剂盒检测患者体内体内AFP-IgM含量的方法，包括下列步骤：

第一步：包被

(1)标准品孔用IgM抗体包被于酶标板孔内；

(2)检测孔用AFP抗体包被于酶标板孔内；

第二步：洗涤酶标板孔，移去包被液；

第三步：通过倍比稀释建立标准品浓度梯度，标准品孔分别加入各个浓度的人免疫球蛋白IgM标准品；样品孔加入稀释的血清或血浆被检标本；并建立阴性、阳性对照，阴性对照为稀释缓冲液，阳性对照为阳性血清；37℃作用2小时，IgM标准品与包被的IgM抗体结合，被检标本中AFP及AFP-IgM与包被的AFP抗体结合；

第四步：洗涤酶标板孔，将未结合的多余样品去除；

第五步：每个凹孔加入兔抗人IgM辣根过氧化物酶标记物溶液，与复合物的IgM端结合；

第六步：洗涤酶标板孔，去除多余的抗IgM-HRP；

第七步：加入底物四甲基联苯胺溶液于每个凹孔，显色。

第八步：每个凹孔加终止剂H₂SO₄；

第九步：观察记录结果，在450nm波长下用酶标仪测定OD值。

第十步：计算检测样品中AFP-IgM浓度，通过倍比稀释建立标准品浓度拟合曲线：y＝ax+b，x为标准品OD值，y为标准品浓度，获得a、b值；测得待测样品OD值为x1，则可计算待测样品浓度y₁＝ax₁+b。

10.权利要求9所述的AFP-IgM含量的检测方法，其特征是包括下列步骤：

第一步：包被

(1)标准品孔包被：用包被缓冲液稀释羊抗人IgM多克隆抗体至0.2μg/ml，96孔酶标板的凹孔加0.3ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱；

(2)检测孔包被：用包被缓冲液稀释鼠抗人AFP单克隆抗体至0.2μg/ml，96孔酶标板的凹孔加0.3ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱；

第二步：每凹孔用洗涤缓冲液洗3次，每次5分钟，移去包被液；

第三步：通过倍比稀释建立标准品浓度梯度，为0μg/L、2μg/L、4μg/L、8μg/L、16μg/L、32μg/L，标准品孔包括6孔，分别加入0.1ml各浓度的人免疫球蛋白IgM标准品，于第五、第六孔各加浓度为32μg/L的标准品0.1ml；样品孔加入0.1ml 5倍稀释血清或血浆被检标本；并建立阴性、阳性对照，阴性对照为稀释缓冲液，阳性对照为阳性血清；37℃作用2小时；

第四步：每凹孔用洗涤缓冲液洗3次，每次5分钟，将未结合的多余样品去除；

第五步：加入酶标抗体，每凹孔加入0.1ml用稀释缓冲液稀释的兔抗人IgM辣根过氧化物酶标记物溶液，浓度为0.5mg/L，37℃作用1小时；

第六步：每凹孔用洗涤缓冲液洗3次，每次5分钟，去除多余的抗IgM-HRP；

第七步：加入0.1ml底物四甲基联苯胺溶液于每个凹孔，室温作用30分钟；

第八步：加终止剂，每凹孔加2M H₂SO₄ 0.05ml；

第九步：观察记录结果，在450nm波长下用酶标仪测定OD值；

第十步：计算检测样品中AFP-IgM浓度，通过倍比稀释建立标准品浓度拟合曲线：y＝ax+b，x为标准品OD值，y为标准品浓度，获得a、b值；测得待测样品OD值为x1，则可计算待测样品浓度y₁＝ax₁+b。