[发明专利]一种检测猪博卡病毒的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种病毒的诊断试剂盒，特别是一种检测猪博卡病毒的试剂盒及方法。

背景技术

博卡病毒属于细小病毒科，而细小病毒科属于最小、最简单的一类单链线状DNA病毒，包括感染鸟类和哺乳动物的细小病毒亚科和感染节肢动物的浓核病毒亚科2个亚家族。细小病毒亚科又包括5个属：细小病毒属、红病毒属、依赖性病毒属、貂阿留申病毒属和博卡病毒属。细小病毒B19属于红病毒属，是HBoV发现之前已知惟一感染人类的细小病毒。2005年瑞典的Allander等报道，他们从患呼吸道感染的婴幼儿的标本中分离到一种新病毒，经对该病毒的基因序列分析发现，这种新病毒是一种单链的，无胞膜的DNA病毒，应归属于细小病毒科。它与所有的其他已知的细小病毒属的病毒一样，含有2个编码非结构蛋白和至少2个衣壳蛋白(VP1和VP2)及中间开放读码框架。在其他的细小病毒中，这个开放读码框架编码具有未知功能的非结构蛋白。新发现病毒的中间开放读码框架的产物和NP1一致，与其他的细小病毒的NP1有47％的氨基酸的一致性。因此，将他们发现的新病毒命名为人类博卡病毒(human bocavirus，HBoV)。在2009年，Blom strom A等利用随机多重置换扩增方法(Random multiple displacementamplification，MDA)在患仔猪断奶后多系统衰竭综合征的猪淋巴结中扩增出了一段长1879bp的核苷酸序列，该段序列与已知病毒序列比较，发现其完整的NP1基因及部分VP1/VP2基因与人类博卡病毒相近，故将该病毒暂时定义为猪博卡病毒(Porcine bocavirus，PBoV)。PBoV在病猪体内被检出，暗示其对猪有一定的致病性。翟少伦等于2010年建立一种检测PBoV的PCR方法。

发明内容

本发明提供了一种检测猪博卡病毒的试剂盒及方法，所述的这种检测猪博卡病毒的试剂盒及方法可以快速准确地检测猪博卡病毒，操作简单，耗时短，灵敏度高，特异性强，解决了现有技术中检测猪博卡病毒的方法复杂，时间长的技术问题。

本发明提供了一种检测猪博卡病毒的试剂盒，其特征在于它含有：

(1)荧光PCR反应液，所述的荧光PCR反应液中含有特异性引物，其上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示；

(2)针对猪博卡病毒的TaqMan特异性探针，探针的序列如SEQ ID NO：3所示，在探针的5’设计有荧光物质，在探针的3’设计有淬灭物质；

(3)博卡病毒质粒的DNA阳性对照。

进一步的，所述的特异性引物的浓度为0.2μM。

进一步的，所述的荧光PCR反应液含有浓度均为200μM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，还含有浓度为3.5mM的Mg²⁺。

进一步的，还含有热启动Taq酶，所述的热启动Taq酶的终浓度为0.03U/μL。

进一步的，在探针的5’设计有FAM荧光物质，在探针的3’设计有带有BHQ的淬灭物质。

本发明还提供了一种用于检测猪博卡病毒的特异性引物，其上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了一种用于检测猪博卡病毒的TaqMan特异性探针，其碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明还提供了一种采用上述的试剂盒检测猪博卡方法，包括以下步骤：

(1)待检样本的DNA提取；

(2)荧光PCR检测：按照扩增对象数量，取荧光PCR反应液、探针Taq酶混于一离心管中，震荡，分装，盖上管盖备用；将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA加入对应反应管中，最后取阳性对照加入一个反应管中，各反应管标记后离心，取出置荧光PCR仪中进行检测；

(3)结果判定：反应液测定Ct值均大于35或无数值的标本为阴性；FAM通道测定Ct≤30的标本为阳性标本；测定30＜Ct＜35的标本建议复测，复测结果Ct＜35为阳性，复测结果Ct≥35的为阴性。

进一步的，荧光PCR扩增条件为：94℃预变性3min；按以下参数循环40次：94℃变性20sec、60℃采集荧光40sec。

猪博卡病毒序列登录号为：FJ872544，其碱基序列如SEQ ID NO：4所示。引物和探针的设计过程如下：