[发明专利]从动物血球液中提取超氧化物歧化酶SOD的新工艺

说明书

技术领域：

本发明涉及一种超氧化物歧化酶SOD的提取工艺，特别是一种从动物血球液中提取超氧化物歧化酶SOD的新工艺。

背景技术：

超氧化物歧化酶，简称SOD，是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内。在体内，SOD能专一清除过多的氧自由基，有效地防御活性氧对生物体的毒害作用，对由超氧阴离子自由基引起的疾病有明显的治疗作用；在体外，SOD具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、增强人体免疫力等多种功能，现广泛应用于医药、食品、保健品、化妆品等行业，市场前景十分广阔。

自上世纪70年代，国外首次报道采用多级沉淀法纯化了CuZn-SOD。到目前为止，国内外的生物学、化学和医药学工作者已采用不同方法从不同的生物资源中分离到了SOD的纯品。这些制备方法主要有溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等，但这些方法多数类同，成本高、工艺繁杂，局限于实验室小规模制取，与SOD的市场需求不适应。

动物血液是国内外正在生产SOD的主力资源，最常见是牛羊的血液。在我国，有着最为丰富的猪血资源，而且价格低廉，具有独特的加工优势。但是由于加工工艺的不完善，以致我国绝大部分动物血液资源未能开发利用，造成宝贵资源严重浪费和环境污染。

发明内容

本发明的目的就在于提供一种从动物血球液中提取超氧化物歧化酶SOD的新工艺，利用该工艺方法提取SOD工艺简捷、成本低廉、操作方便，适合工业化生产的新工艺。

如上构思，本发明的技术方案是：一种从动物血球液中提取超氧化物歧化酶SOD的新工艺，其特征在于：依照下列步骤完成：

(1)在新鲜的动物血液中加入柠檬酸钠做抗凝处理，离心收集红细胞，然后加入红细胞体积1-3倍的去离子水，不断搅拌，使红细胞破碎，得溶血液；

(2)向溶血液中加入单价中性金属盐，调节PH值到4.0-7.0，加热至55-75℃，保温反应30-100min，冷却至室温，离心取上清，得SOD粗提液；

(3)用中空纤维超滤装置对SOD粗提液进行超滤浓缩得SOD浓缩液；

(4)向SOD浓缩液中边搅拌边缓慢加入0.4-1倍体积的预冷丙酮，离心取上清液；

(5)然后向步骤(4)所得的清液中边搅拌边缓慢加入1.2-1.5倍体积的预冷丙酮，离心取沉淀；

(6)将沉淀用去离子水溶解，经过阴离子交换树脂或分子筛层析，冷冻干燥即可得SOD精品冻干粉。

上述抗凝处理时所使用的抗凝剂为食品级柠檬酸钠，添加量为3.5-5g/Kg动物血，搅拌溶血时间30-120min。

上述单价中性金属盐可以是碱金属的氯化物、溴化物、硝酸盐和硫酸盐中的任一种或几种的混合物，至其终浓度为0.1-1.5mol/L。

上述步骤(3)使用的中空纤维超滤装置选择截留分子量为4K-15K的膜组件，保持回流压0.04-0.1MPa。

上述步骤(6)中使用的阴离子交换层析是DEAE阴离子交换层析，层析柱先用pH6.5～8.0的2.5mM的磷酸缓冲液平衡，至280nm无光吸收，然后上样，换用单一浓度的洗脱液洗脱至280nm无光吸收，收集SOD活力峰。其中的单一浓度洗脱液为与平衡层析柱的缓冲液pH相同、浓度为4～8mM的磷酸缓冲液。

上述步骤(6)中使用的分子筛柱层析是Sephadex G100或Sephadex G25柱层析，层析柱先用蒸馏水平衡，然后上样，再以蒸馏水洗脱，收集SOD活力峰。

本发明的优点在于：

(1)不使用乙醇氯仿，大大降低了生产成本，改善了工作环境，减少了对操作人员的毒害；

(2)采用热变性去除血红蛋白，溶血过程能在常温下进行，使操作更简便，降低能耗；

(3)在以往的SOD提取中，往往添加大量金属盐来提高SOD的活性，但是很容易造成金属离子超标，且得不到纯净的SOD；本工艺不添加过渡金属盐如铜盐、锌盐、锰盐中的任何一种，既控制了金属盐离子的超标，又节约了大量的成本；

(4)引入了超滤浓缩装置，既能有效的对SOD进行一定程度的纯化，又极大的压缩了浓缩液的体积，使得丙酮的用量大幅度的减少，操作起来方便快捷，适合大规模工业化生产。

具体实施方式：

实施例1

(1)采集新鲜猪血175L加入7L浓度为10％的柠檬酸钠抗凝，用管式离心机连续分离得70L血球和112L血浆。血浆经喷雾干燥成血浆蛋白粉，血球泵入反应罐中，同时加入70L的去离子水搅拌60min使血球破碎，制得溶血液140L；