[发明专利]一种辅酶A的制备工艺

说明书

技术领域

本发明涉及一种辅酶A的制备工艺。

背景技术

辅酶A，Coenzyme A简称CoA，它是由β-巯基乙胺、4’-磷酸泛酸、5’-二磷酸腺苷组成。CoA在生物体内主要作为转乙酰基的辅酶。CoA是体内乙酰化反应的辅酶，对体内糖、脂质及蛋白质的代谢起着重要的作用，如三羧酸循环、肝糖原的积存、乙酰胆碱的合成、胆固醇的降低及血浆脂肪含量的调节等。临床用于动脉硬化、心肌梗塞、多种肝病包括肝炎、脂肪肝等症、血小板减少性紫斑、白细胞减少症、尿毒症、糖尿病酸中毒、功能性低热的辅助治疗等。辅酶A原料药为白色或淡黄色粉末，有类似蒜臭味，是体内乙酰化反应的辅酶，对糖、脂肪和蛋白质的代谢起重要作用。

辅酶A是通过微生物发酵、酶促合成、大孔树脂吸附、氧化亚铜提纯、葡聚糖凝胶层析精制而得。目前市场普遍存在微生物发酵单位低(发酵单位在300～400u/ml之间，平均在330u/ml)、发酵液杂质多后续分离纯化难度大、最终收率低等缺陷。

发明内容

针对上述现有技术中存在的发酵表达量低、活力单位收率少等缺陷，本发明提供了一种高活力发酵表达的辅酶A的制备工艺，本发明对微生物发酵培养基配比进行了改进，对适合微生物生长的葡萄糖、玉米浆及适合生物酶合成的蛋白胨、无机盐等进行了优化组合，筛选出了最适的微生物发酵酶促合成反应配比，使得微生物菌量与生物酶促合成达到平衡，辅酶A的生物合成表达最大化。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种辅酶A的制备工艺，包括微生物发酵、酶促合成、大孔树脂吸附、氧化亚铜提纯、葡聚糖凝胶层析和还原沉淀六部分，其中，微生物发酵包括菌种选育、菌种发酵两个阶段；所述菌种发酵阶段，所采用的培养基的配方组成如下：葡萄糖：8％～10％；玉米浆：1.3％～1.5％；牛骨或鱼蛋白胨：1.5％～1.8％；硫酸镁：1.0％～1.2％；氯化钙：0.01％～0.02％，尿素0.8％～1.0％，余量为水，各组分按重量百分比。

优选的，所述养基的配方组成如下：葡萄糖：10％；玉米浆：1.4％，牛骨蛋白胨：1.5％；硫酸镁：1.0％；氯化钙：0.01％，尿素0.8％，余量为水。

优选的，所述菌种发酵阶段，发酵条件为：温度30～35℃，空气流量1∶(0.6～1.0)，时间20～26小时，发酵完成后，检测pH值、OD值、残留糖量并镜检有无杂菌。

优选的，在所述菌种选育阶段，选用产氨短杆菌，理由为：能进行辅酶A酶合成反应的菌种很多，如酵母菌、短杆芽孢杆菌、假单孢菌、产氨短杆菌等；国内外文献报道表明，产氨短杆菌通过发酵富集菌量然后进行酶促合成辅酶A产量是最高的，因此选用产氨短杆菌。

优选的，在所述酶促合成部分，向酶反应液中分次加入1次、2次或3次前体物质盐酸半胱氨酸、泛酸钙和三磷酸腺苷二钠，进一步优选的，向酶反应液中分加入1次前体物质盐酸半胱氨酸、泛酸钙和三磷酸腺苷二钠。

优选的，所述前体物质盐酸半胱氨酸、泛酸钙和三磷酸腺苷二钠按酶反应液的重量百分比添加，添加量分别为0.1％～0.2％盐酸半胱氨酸、0.07％～0.08％泛酸钙、0.2％～0.3％三磷酸腺苷二钠。

优选的，所述酶促合成部分，酶反应温度30～35℃，空气流量1∶(0.3～0.6)，时间20～24小时，反应过程中不断地搅拌；反应后，得反应液，反应液酸化压滤，得压滤清液。

本发明的辅酶A的制备工艺具体步骤可以如下：

(一)微生物发酵

辅酶A发酵菌种经发酵培养，温度30～35℃，空气流量1∶(0.6～1.0)，时间20～26小时，检测pH值、OD值、残留糖量并镜检无杂菌。

(二)酶促合成

向酶反应液中逐步加入前体物质盐酸半胱氨酸、泛酸钙、三磷酸腺苷二钠，酶反应温度30～35℃，空气流量1∶(0.3～0.6)，时间20～24小时。搅拌得反应液，反应液酸化压滤，得压滤清液。

(三)大孔树脂吸附

压滤清液上已处理好的CAD型大孔树脂吸附，低浓度乙醇淋洗除杂质，碱性乙醇液洗脱得到分离液，洗脱液真空浓缩，得浓缩液。

(四)氧化亚铜提纯

浓缩液加入盐酸半胱氨酸，硫酸调节pH，加入氧化亚铜，使辅酶A形成巯醇盐沉淀，用无盐水洗涤沉淀，用硫化氢脱除铜，离心后浓缩得浓缩液。

(五)葡聚糖凝胶层析