[发明专利]核酸检测

说明书

本申请是申请日为2006年3月23日的中国专利申请200680017932.0“核酸检测”的分案申请。

技术领域

本发明涉及核酸检测领域。

背景技术

在分子诊断领域中，检测核酸内容物中的微小差异是一项重要的工作。

检测少量核酸最常用的方法是PCR或RT-PCR。在测定给定样品中目标序列与否存在时，这些方法执行的特别好，但为了测定两条序列浓度之间是否存在差异，则需要大约2倍的差异。

核酸的定量分析在例如质量控制、基因表达分析、医疗监护以及诊断中使用。本文所述方法显著改善了这些测量的精确度，在科学和医药领域中开辟了新的潜在应用。

发明内容

在一方面，本发明提供了用于定量核酸样品中核酸序列数量的改良方法。该所要求保护的方法可使样品中具有给定序列的核酸的量的精确测定，包括小于2倍差异的精确测定成为可能。

在一方面，该方法依赖于使PCR反应失平衡的方法。当反应以该方式失平衡时，在模板和互补链之间形成了不对称性，使随后反应中期望产物和不期望产物之间的区别成为可能，又使得核酸样品中非常小的核酸序列的量的差异的灵敏检测成为可能。

因而，在一个实施方案中，提供了使PCR反应失平衡的方法，包含步骤：a)在包括原始目标核酸序列(模板)、其互补核酸序列以及相应的第一和第二PCR引物的PCR反应中产生产物；和b)添加过量的与第一和第二PCR引物中的任一引物互补的核酸破坏序列。在以下讨论中，破坏序列与第一引物互补。当破坏序列被容许在下一个退火循环中杂交时，其通过退火至第一引物以及一条或另一条原始(模板)序列或其互补序列，而非两条序列(取决于这两条链中哪条与破坏序列互补)，主要形成了破坏序列对。因随后延伸所产生的产物失平衡，而产生了或为模板或为其互补链的一条链，而非两条链。换句话说，在破坏序列杂交后的延伸基础上，主要产生了：a)在一条链中带有缺口的双链原始(模板)序列和单链互补序列，或b)在一条链中带有缺口的双链互补序列和单链原始(模板)序列。以单链或双链形式所产生的产物的特性是由两条PCR引物中与破坏序列互补的那一条所决定的。检测单链产物使靶序列原始的量的灵敏测定成为可能。

在另一方面，提供了一种通过交联锁定双链DNA进而在反应混合物中用于阻断可能发生的基于PCR的扩增的方法。该交联阻止了扩增并由此在交联时检测双链DNA。该扩增的阻断可使更灵敏的未交联产物的检测成为可能。该交联可通过如UV或化学处理得以实现。

在另一方面，提供了一种用于测定在核酸样品中相对于参比核酸的量的靶核酸的量的方法。该方法包括对参比和靶核酸以及参比和靶核酸两者的正向和反向PCR引物的合并混合物进行PCR。参比核酸的反向PCR引物含有与靶核酸上所存在的序列相同的尾部(tail)序列。在给定次数的PCR循环后，通过添加过量的两种核酸破坏序列并让它们与单链PCR产物杂交而破坏反应的对称性。第一破坏序列与靶探针的反向引物互补，第二破坏序列则与参比探针的反向引物互补，但不包括与靶核酸上所存在的序列相同的尾部区。在破坏后，检测留下的单链靶或参比核酸，使得相对于参比核酸的原始样品中的靶核酸的量得以测定。

附图说明

图1显示了PCR反应受控破坏以形成单链模板(ABC)和双链互补物(C′B′A′)的示意图。第一步显示了原始基因组DNA序列(也称为模板，ABC)和相应的正向和反向PCR引物(分别为A和C)。在第二步中，显示了几次PCR循环的产物。在期望数目的PCR步骤完成之后，该示意图显示了以相对于PCR引物过量，添加与反向引物(C′)互补的破坏序列(C)。当冷却时，过量的破坏序列会结合反向引物以及互补序列。与此同时，正向引物则会结合互补序列并延伸，形成在B和C连接处带有缺口的双链互补物。因此，模板(ABC)得以保留单链。

图2显示了如何使用交联从随后的PCR或其他检测反应中除去双链DNA的示意图。第1步显示了序列以单链和双链形式存在。添加交联剂永久性或半永久性将双链DNA结合在一起，阻止了在PCR循环的高温步骤期间的完全解离(第3步)。其选择性地阻止了例如通过PCR的双链DNA扩增，但不限制单链DNA扩增。