[发明专利]一种高灵敏度免疫芯片检测系统及其使用方法

权利要求书

1.一种高灵敏度蛋白芯片检测系统，其特征在于：它包括芯片反应系统和显色系统；芯片反应系统包括载体、反应液和洗涤液；显色系统包括检测液和终止液；

所述载体上包被有能与生物学指标特异性结合的探针点阵或质控点；

反应液包括两种，一种为能与生物学指标结合的生物素标记物，另一种为过氧化物辣根酶与链霉亲和素的复合物；或者

反应液为过氧化物辣根酶标记的能与生物学指标相结合的物质；

终止液为0.01～10.0（w/v）%的叠氮钠溶液。 

2.根据权利要求1所述的一种高灵敏度蛋白芯片检测系统，其特征在于，所述洗涤液的配方如下：0.1～10（v/v）%的TWEEN-20、0.01～0.2摩尔每升pH6～8的 PB缓冲液、0.1～20（v/v）%的proclin300。

3.根据权利要求1或2所述的一种高灵敏度蛋白芯片检测系统，其特征在于：所述检测液包括pH4～7的A液和pH2～7的B液，A液包括H₂O₂和柠檬酸-磷酸氢二钠溶液，B液包括TMB-HCl和柠檬酸钠-盐酸溶液；其中，H₂O₂浓度为0.005～0.5（v/v）%、柠檬酸-磷酸氢二钠溶液浓度为0.01～0.2摩尔每升；柠檬酸钠浓度为0.01～0.1摩尔每升，B 液中TMB-HCl的浓度为0.01～1.0毫克每毫升。

4.根据权利要求1或2所述的一种高灵敏度蛋白芯片检测系统，其特征在于：所述载体为孔径在0.1～12微米的多孔性微孔滤膜。

5.根据权利要求4所述的一种高灵敏度蛋白芯片检测系统，其特征在于：所述多孔性微孔滤膜为纤维素类微孔滤膜、尼龙类微孔滤膜或聚氟乙烯类微孔滤膜。

6.根据权利要求1或2所述的一种高灵敏度蛋白芯片检测系统，其特征在于：所述载体为聚乙烯、聚苯乙烯、硅橡胶或玻璃材料制成的各种可用于生物学检测的承载体。

7.一种高灵敏度蛋白芯片检测系统的使用方法，包括以下步骤：

1）蛋白反应芯片的制作

用点样仪将一种或多种能与生物学指标结合的探针溶液或质控点以点阵的形式固化于载体上，室温干燥，2～8℃密封保存；

2）点样稀释液的配制

配制浓度为0.01～0.5摩尔每升的PB缓冲液，其中含有浓度为0.01～20%的水溶性色素；

3）封闭液的配制

封闭液的配方如下：浓度为1～10（w/v）%的BSA溶液、浓度为1～10（w/v）%的蔗糖溶液、浓度为0.1～10（v/v）%的TWEEN-20、0.1～20（v/v）的proclin300、浓度为0.01～0.2摩尔每升 pH为6～8的 PB缓冲液；

4）洗涤液的配制

洗涤液的配方如下：0.1～10%（v/v）的TWEEN-20、0.01～0.2摩尔每升pH6～8的 PB缓冲液、0.1～20（v/v）%的proclin300；

5）能与生物学探针结合物质的生物素标记

①用无水DMSO配置1～20毫克每毫升的生物素Ｎ－羟基琥珀酰亚胺酯溶液；

②用浓度为0.01～0.2摩尔每升pH6～9的硼酸盐缓冲液为溶剂配制浓度至少为0.5～5毫克每升的能与生物学探针结合的物质的溶液；

③按10～200微克每毫克的比率将生物素酯加入上述能与生物学探针结合的物质的溶液中，混合均匀后并在室温下孵育1 h～6h；

④按每100～500微克生物素酯内加入1～100微升的浓度为0.5～2.0摩尔每升的氯化铵，室温孵育5～60min；

⑤将经过步骤③的能与生物学探针结合的物质的溶液用0.01～0.2 摩尔每升的 PBS、CBS、醋酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液透析2～48h进行纯化，或再用蛋白A或蛋白G层析柱再次纯化能与生物学探针结合物质；

6）链霉亲和素或能与生物学探针结合的物质与过氧化物辣根酶的复合物标记

①新鲜配制1.0～10.0毫克每毫升的HRP溶液；

②向HRP溶液中加入0.1～1.0ml新鲜配制的0.01～2.0摩尔每升的过碘酸钠，室温下避光静置或搅拌；

③将步骤②制得的溶液装入透析袋中，用1～10 毫摩每升的pH为4～7的醋酸钠缓冲液进行透析，2～6℃静置或搅拌；

④向步骤③制得的溶液中加入10～100微升0.1～1.0摩尔每升的 pH为7～10碳酸盐缓冲液；

⑤向步骤④制得的溶液中加入0.1～10毫克的链霉亲和素或能与生物学探针结合的物质，室温避光轻轻搅拌1～6小时；

⑥向步骤⑤制得的溶液中加0.1～1.0毫升新鲜配制的浓度为1～10毫克每毫升的NaBH_４溶液混匀，2～6℃静置1～6小时；

⑦将步骤⑥制得的溶液装入透析袋中，用0.01～0.2摩尔每升pH为6～8的PBS溶液进行透析，2～6℃，过夜；

⑧将步骤⑦制得的透析液，在1000～10000 rpm条件下离心去沉淀，上清液为含HRP-链霉亲和素或HRP-能与生物学探针结合物质的复合物；

7）检测液的配制

检测液包括 pH4～7的A液和pH2～7的B液，A液包括H₂O₂和柠檬酸-磷酸氢二钠溶液，B液包括TMB-HCl和柠檬酸钠-盐酸溶液；其中，H₂O₂浓度为0.005～0.5（v/v）%、柠檬酸-磷酸氢二钠溶液浓度为0.01～0.2摩尔每升；柠檬酸钠浓度为0.01～0.1摩尔每升，B 液中TMB-HCl的浓度为0.01～1.0毫克每毫升；

8）终止液的配制

配制浓度为0.01～10.0（w/v）%的叠氮钠溶液;

具体操作如下：

首先将检测样本加到蛋白芯片上，通过摇床温育的方式，使样本溶液中多种生物学指标与芯片载体上包被的对应探针进行特异性的反应结合，然后将反应完成的载体用洗涤液进行洗涤，以减少其它干扰物质的非特性结合；接下来加入步骤5）制备的生物素标记好的能与生物学探针结合物质和步骤6）制备好的过氧化物辣根酶和链霉亲和素的复合物或HRP-能与生物学探针结合物质的复合物，进行摇床温育，这样就形成了载体-探针-生物学指标-步骤5）制备的生物素标记的能与生物学探针结合物质-链霉亲和素-过氧化物辣根酶的复合物或载体-探针-生物学指标-能与生物学探针结合物质-过氧化物辣根酶的复合物，再将反应完成的载体表面用洗涤液进行洗涤，再加入检测液A液与B液的混合液以及终止液，完成整个芯片的反应过程，最后弃去载体上所有液体；如果待测样本中含有目标检测的生物学功能指标，在显色完成后通过肉眼颜色识别完成样本的检测，或通过检测系统完成对颜色点阵的信号读取后与检测仪中设置的色卡进行自动比对完成样本的检测；

或

首先将封闭液滴加蛋白芯片中，再将检测样本加入蛋白芯片中，使样本溶液中的生物学指标与芯片载体上包被的对应探针进行特异性的反应结合，然后将反应完成的膜面滴加洗涤液进行洗涤，以减少其它干扰物质的非特性结合，接下来加入步骤5）制备的生物素标记好的能与生物学探针结合物质和步骤6）制备好的过氧化物辣根酶和链霉亲和素的复合物或HRP-能与生物学探针结合物质的复合物，进行摇床温育，这样就形成了载体-探针-生物学指标-步骤5）制备的生物素标记的能与生物学探针结合物质-链霉亲和素-过氧化物辣根酶的复合物或载体-探针-生物学指标-能与生物学探针结合物质-过氧化物辣根酶的复合物，再将反应完成的载体表面用洗涤液进行洗涤，再加入检测液A液与B液的混合液以及终止液，完成整个芯片的反应过程，最后弃去载体上所有液体；如果待测样本中含有目标检测的生物学功能指标，在显色完成后通过肉眼颜色识别完成样本的检测，或通过检测系统完成对颜色点阵的信号读取后与检测仪中设置的色卡进行自动比对完成样本的检测。