[发明专利]过敏原花生蛋白的时间分辨免疫荧光分析检测方法

说明书

技术领域

一种检测食品过敏原花生蛋白成分的检测方法，属于时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）技术领域，用于对食品中过敏原花生蛋白的含量检测。

背景技术

在食物过敏中，花生过敏反应表现的症状最为严重，即使微量的食入也能诱导明显的花生过敏反应，会出现过敏性休克和过敏性至死的现象。目前，对于这一花生过敏症状至今尚无有有效的治疗方法。避开花生过敏原的食入可有效地防止严重过敏反应的发生，成为了预防花生过敏的有效途径之一。美国及欧盟等国家食品标签法中规定必须把花生作为主要过敏原成分加以标示并开始对部分进口食品进行花生过敏原检测，甚至将食品过敏原成分的标签成为食品国际贸易技术壁垒的新手段之一。

在当前商用的花生过敏原检测试剂中，主要是有三种方法：ELISA，胶体金法（LFIA）和实时荧光定量PCR法。ELISA和LFIA的蛋白检测方法主要是检测食品中的花生总蛋白或花生主要过敏原（Ara h 1或Ara h 2），LFIA仅能提供是/否的检测结果，ELISA可以半定量或全定量检测更为灵敏一些但需要更多的时间。而商用的实时荧光定量PCR试剂主要是检测食品中的花生主要过敏原基因DNA水平， LOD约10-50 ppm。

TRFIA是上世纪八十年代初发展起来的新的免疫测定技术，该技术比Elisa的灵敏度有很大的提高。其原理是利用镧系元素的独特的荧光发光特点，镧系元素荧光光谱的激发光与发射光之间的Stokes位移较大，同时被激发的荧光光带极窄，荧光的发射峰非常尖锐，可使仪器调整在极窄的波长范围内测定，几乎完全消除了背景荧光的干扰，继而通过时间延迟和波长分辨，将强特异性荧光和背景荧光分辨开（称为时间分辨），使干扰达到几乎为零。同时增强液的使用是另一个关键因素，免疫反应完成后复合物中镧系离子自身荧光信号很微弱，加入一种增强剂，使镧系元素从复合物中解离下来，并与增强液中所含的β-萘甲酰三氟丙酮（β-NTA）重新形成微胶囊，在紫外等光的激发下发射很强的荧光，增强效果上百万倍。    

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测食品中花生过敏原蛋白成分的检测方法，用于对食品中花生蛋白含量的检测。

本发明主要采用时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）检测食品中过敏原花生成分的含量。技术方案：测定的基础是双单抗夹心免疫反应。包被有抗花生过敏原Ara h1蛋白单克隆抗体5G4的微孔板，加入花生过敏原Ara h1蛋白标准品或已处理好的样品到各自的微孔中，振荡反应后洗涤液洗涤，加入生物素标记的抗花生过敏原Ara h1蛋白单克隆抗体2G9，振荡反应，洗涤液洗涤3次，没有结合的抗体在洗涤步骤中被除去。加入EU³⁺-链霉亲和素，振荡反应，洗涤液洗涤3次，反应后没有结合的EU³⁺-链霉亲和素在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后，在紫外光的激发下发射很强的荧光，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的浓度成正比，对照标准曲线即可确定样品中花生过敏原Ara h1蛋白含量，因为花生中Ara h1蛋白占花生总蛋白的12-16%，由此换算出样品中的过敏原花生蛋白含量。

附图说明

图1：花生过敏原蛋白-TRFIA反应示意图。A：花生过敏原Ara h1单克隆抗体；B：花生过敏原Ara h1蛋白；C：生物素标记的花生过敏原Ara h1单克隆抗体；D：铕标记的链霉亲和素。

图2：花生过敏原蛋白-TRFIA标准曲线图。

具体实施方式

实施例是对本发明所提供的过敏原花生蛋白的时间分辨免疫荧光分析检测方法的进一步说明，但发明的实施方式不限于此。

（1）抗体生物素标记：

将纯化后过敏原Ara h1蛋白单克隆抗体2G9的原缓冲液替换成磷酸盐缓冲溶液（PBS），然后将单克隆抗体5G4与NHS活化的生物素（NSH-Biotin）按合适的比例混合，避光反应30min，用50kDa的超滤膜柱去除可能未参与标记的NSH-Biotin。

（2）包被板的制备：

将纯化的抗花生过敏原Ara h1蛋白单克隆抗体5G4用50mmol/L Na₂CO₃-NaHCO₃ pH9.6缓冲液稀释至合适浓度, 96孔微孔板各孔加100μl，4℃放置过夜。弃去包被液，用含0.05 % Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBST）冲洗两次，加150μl含3g/L BSA的上述缓冲液封闭，4℃放置过夜。弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。