[发明专利]采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及到药用蛋白酶的生化分离技术，尤其是涉及一种采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法。

背景技术

胰蛋白酶是从牛胰腺或猪胰腺中分离纯化得到的一种蛋白酶。它在药理和临床上的功用主要有：分解液化血凝块、脓性分泌物、坏死组织等，能使脓液变稀，易于引流并能促进伤口愈合。

国内提取胰蛋白酶的工艺长期以来一直采用多重结晶结合透析的工艺，多重结晶工艺复杂、纯化能力弱，透析工艺耗时长、不便于规模化生产，以这种传统工艺生产的产品活性一般在2000-2500单位/毫克，最高只能达到2700单位/毫克左右。

根据分析，胰蛋白酶工艺未获得重大突破的原因有二：一是生产厂家的工艺惯性，工艺一旦稳定不轻易变动；二是亲和层析技术本身的技术难度使得开发以亲和层析工艺来制备胰蛋白酶的技术不是那么容易。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种工业化的高效手段采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)获取生产用原料：将新鲜的牛胰或猪胰进行冷冻保存，得到冷冻原料；

(2)原料粉碎、提取蛋白：用粉碎机将冷冻原料直接粉碎成浆状，加入三倍体积预冷的0.25N硫酸溶液，控制温度为4℃搅拌提取3-5h，放置过夜，次日将提取液进行固液分离，在清液中加入硫酸铵至30％饱和度，并加入硅藻土助滤，控制温度为4℃放置过夜后过滤，得到的清液即为提取液；

(3)分级盐析、酶原沉淀：在提取液中再补充硫酸铵至70％饱和度，控制温度为4℃放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀，用1.5倍重量的冰水溶解沉淀，加入0.5倍重量的饱和硫酸铵溶液，调节pH至5，在25℃下保温静置48h，过滤收集滤液，再补充硫酸铵至70％饱和度，控制温度为4℃放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀，得到胰蛋白酶粗品；

(4)粗品酶解：胰蛋白酶粗品用10倍体积的去离子水溶解，调节pH到8.0，在每升溶解液中加入5mg高纯胰蛋白酶，控制温度为4℃酶解48h，酶解后的溶液离心得到酶解液，根据中国药典2010年版第二部的相应方法测定酶解液中胰蛋白酶的效价，进行质量跟踪；

(5)亲和层析分离纯化：将亲和层析介质装柱，用0.1M Tris-Hcl，pH8.0缓冲液作为平衡液进行平衡，平衡后直接用酶解液上样，控制流速在30cm/h，上样完毕，用上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD₂₈₀值小于0.1，然后用0.1mol/L 甲酸-0.05mol/L KCl，pH2.2缓冲液洗脱，流速为50cm/h，收集洗脱峰；

(6)超滤浓缩除菌：采用超滤膜对收集的洗脱峰进行浓缩，将浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌；

(7)真空冷冻干燥得到成品：采用真空冷冻干燥技术，将过滤除菌后得到的酶液直接冷冻干燥，即得到高纯度胰蛋白酶成品，成品取样，参照中国药典2010年版第二部的要求，进行全项测定。

步骤(2)中所述的固液分离采用的装置为机电一体化箱式板框过滤设备，而非传统的布袋压滤。

所述的硫酸铵为试剂级溶剂。

步骤(4)中所述的酶解使用的胰蛋白酶为高纯度的胰蛋白酶，活性＞3300u/mg。

步骤(5)中所述的亲和层析介质以GE Health凝胶介质为基础，接上慈菇蛋白酶抑制剂作为配基而得，使用的层析缓冲液为0.1M Tris-Hcl，pH8.0缓冲液，使用的洗脱液为0.1mol/L甲酸-0.05mol/L KCl，pH2.2缓冲液，用这种创新的亲和层析纯化方法，可以一步纯化胰蛋白酶，是生产高纯度胰蛋白酶的关键。

所述的慈菇蛋白酶抑制剂的加入为10mg/ml凝胶介质。

步骤(6)中所述的超滤膜的截流分子量为10000。

步骤(7)中所述的真空冷冻干燥中酶液的冷冻温度为-40℃以下。

本工艺的路线如下所示：

新鲜冷冻牛胰或猪胰→粉碎提取→板框过滤→分级盐析→酶原沉淀→酶原酶解→亲和层析→超滤浓缩→除菌过滤→冷冻干燥→成品