[发明专利]采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法

权利要求书

1.采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)获取生产用原料：将新鲜的牛胰或猪胰进行冷冻保存，得到冷冻原料；

(2)原料粉碎、提取蛋白：用粉碎机将冷冻原料直接粉碎成浆状，加入三倍体积预冷的0.25N硫酸溶液，控制温度为4℃搅拌提取3-5h，放置过夜，次日将提取液进行固液分离，在清液中加入硫酸铵至30％饱和度，并加入硅藻土助滤，控制温度为4℃放置过夜后过滤，得到的清液即为提取液；

(3)分级盐析、酶原沉淀：在提取液中再补充硫酸铵至70％饱和度，控制温度为4℃放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀，用1.5倍重量的冰水溶解沉淀，加入0.5倍重量的饱和硫酸铵溶液，调节pH至5，在25℃下保温静置48h，过滤收集滤液，再补充硫酸铵至70％饱和度，控制温度为4℃放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀，得到胰蛋白酶粗品；

(4)粗品酶解：胰蛋白酶粗品用10倍体积的去离子水溶解，调节pH到8.0，在每升溶解液中加入5mg高纯胰蛋白酶，控制温度为4℃酶解48h，酶解后的溶液离心得到酶解液；

(5)亲和层析分离纯化：将亲和层析介质装柱，用0.1M Tris-Hcl，pH8.0缓冲液作为平衡液进行平衡，平衡后直接用酶解液上样，控制流速在30cm/h，上样完毕，用上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD₂₈₀值小于0.1，然后用0.1mol/L甲酸-0.05mol/L KCl，pH2.2缓冲液洗脱，流速为50cm/h，收集洗脱峰；

(6)超滤浓缩除菌：采用超滤膜对收集的洗脱峰进行浓缩，将浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌；

(7)真空冷冻干燥得到成品：采用真空冷冻干燥技术，将过滤除菌后得到的酶液直接冷冻干燥，即得到高纯度胰蛋白酶成品。

2.根据权利要求1所述的采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的固液分离采用的装置为机电一体化箱式板框过滤设备。

3.根据权利要求1所述的采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法，其特征在于，所述的硫酸铵为试剂级硫酸铵。

4.根据权利要求1所述的采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的酶解使用的胰蛋白酶为高纯度的胰蛋白酶，活性＞3300u/mg。

5.根据权利要求1所述的采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法，其特征在于，步骤(5)中所述的亲和层析介质以GE Health凝胶介质为基础，接上慈菇蛋白酶抑制剂作为配基而得，使用的层析缓冲液为0.1M Tris-Hcl，pH8.0缓冲液，使用的洗脱液为0.1mol/L甲酸-0.05mol/L KCl，pH2.2缓冲液。

6.根据权利要求5所述的采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法，其特征在于，所述的慈菇蛋白酶抑制剂的加入为10mg/ml凝胶介质。

7.根据权利要求1所述的采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法，其特征在于，步骤(6)中所述的超滤膜的截流分子量为10000。

8.根据权利要求1所述的采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法，其特征在于，步骤(7)中所述的真空冷冻干燥中酶液的冷冻温度为-40℃以下。