[发明专利]鱼腥蓝细菌2-酮基-肌醇脱氢酶基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及鱼腥蓝细菌基因工程技术领域，具体涉及鱼腥蓝细菌2-酮基-肌醇脱氢酶基因，本发明还涉及该基因的克隆方法及其在抗百草枯除草剂转基因植物中的应用。

背景技术

杂草控制是农业生产管理中的重要环节。传统的杂草控制主要通过不断耕耘及人工除草进行。上个世纪四十年代，随着对杂草的化学控制技术的深入发展，一系列用于杂草控制的化学除草剂开始大量出现。目前应用最广泛的除草剂包括苯氧羧酸类的二四滴及其衍生物；苯甲酸类如百草敌等；有机磷类如草甘膦及其衍生物；联吡啶类如百草枯等。

抗除草剂转基因作物通过增加作物对特定除草剂的耐受能力，能够一次性高效杀灭杂草，进行无耕种植，减少水土流失；尤其在草坪工业、育种育苗领域有着传统除草剂难以比拟的优势。同时抗除草剂作物也能极大减轻除草剂本身对于作物的影响，增加农业产量。世界上第一个抗除草剂转基因作物是1996年美国出现的抗草甘膦转基因大豆，此后抗除草剂转基因油菜、棉花、玉米、甜菜、苜蓿等陆续推出商用种植。抗除草剂转基因作物的物质基础是抗除草剂的基因资源的分离和运用。以抗草甘膦为例，目前已经运用的主要有超表达EPSPs(5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶)或超表达草甘膦氧化酶和草甘膦N-乙酰转移酶来解除草甘膦对作物的毒性等。目前商品化最为广泛的是美国孟山都公司所拥有的Roundup Ready作物。目前全球已经有超过50个抗除草剂转基因作物进行了商业种植，主要的除草剂与抗性基因搭配为草甘膦---CP4epsps，草丁膦-pat或者bar，辛酰卤苯腈---bxn，磺酰脲类-surB。

“百草枯”又名“克无踪”，是世界上用量第二大的除草剂，仅次于草甘膦。它具有非选择性和触杀特性，因此被广泛用于农业和园艺除草以及棉花、大豆等的催枯。百草枯的作用机理是通过干扰光合植物的光合反应中心I(PSI)附件的电子传递，并介导生成活性氧(Reactive oxygen species)组分，对细胞产生致死效应。目前认为细胞主要通过增加对百草枯的外排能力或者降低其吸收能力来降低细胞内的百草枯浓度，从而提升对环境百草枯的抗性。目前尚无抗百草枯转基因作物的报道。涉及百草枯抗性的相关基因主要是一些编码ABC型转运子的基因如大肠杆菌的emrB、emrE等(Prosecka，Orlov et al.2009)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来自鱼腥蓝细菌的2-酮基-肌醇脱氢酶基因，以及该基因的克隆方法及其在抗百草枯除草剂转基因植物中的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种鱼腥蓝细菌2-酮基-肌醇脱氢酶基因，该基因是由1116个核苷酸组成，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

上述鱼腥蓝细菌2-酮基-肌醇脱氢酶基因所编码的多肽，由371个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。多肽的分子量大小约为41.22千道尔顿(kDa)。

上述鱼腥蓝细菌2-酮基-肌醇脱氢酶基因的克隆方法包括以下步骤：

(1)分离鱼腥蓝细菌总DNA；

(2)根据鱼腥蓝细菌的基因组序列，设计上下游引物：上游引物为GCCCATATGTTGGCAAAAAATGAG；下游引物为GCCCTCGAGGGAAATAGGTTATAAGTC，在上下游引物中分别引入NdeI和XhoI核酸内切酶酶切位点；

(3)以鱼腥蓝细菌总DNA为模板，利用上下游引物进行PCR扩增，得到PCR产物；

(4)回收PCR产物；

(5)将PCR产物利用NdeI和XhoI核酸内切酶连入克隆载体pBSpetE中，构建重组质粒；

(6)用重组质粒转化大肠杆菌，进行培养、活化。

该基因在光合模式生物蓝细菌中进行超量表达，能够显著提高转基因菌株对除草剂百草枯的抗性，揭示了该基因在构建抗除草剂转基因植物中的广阔应用前景。利用本发明所构建的转基因光合细菌对除草剂百草枯的抗性得到显著提高，这为开展抗除草剂转基因作物提供了新的候选基因资源。

附图说明

图1：是本发明实施例中构建克隆载体pBSpetE1580和超表达载体pRL25TpetE1580的示意图；

图2：是本发明实施例分离转基因蓝细菌中的重组质粒的酶切后的凝胶电泳图；

M：是分子量标准；

1：重组质粒经过NotI和XhoI双酶切的琼脂糖凝胶电泳结果。