[发明专利]CSFV、PCV2与PRV多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪病毒的检测方法，具体涉及CSFV、PCV2与PRV多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物及检测方法。

背景技术

猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)都能够不同程度的导致妊娠引起种猪不育，即公猪睾丸肿胀，精液质量下降，失去种用能力；母猪表现为不发情，返情，不孕；妊娠母猪发生流产、早产、死胎、木乃伊、弱仔及新生仔猪发病且导致大量死亡等，给养猪业造成了巨大的经济损失。对这类传染病的有效控制是保证养猪业健康发展的关键因素之一。

目前，国内外对以上三种病毒已经有大量的相关研究，建立了病毒分离、ELISA检测方法、免疫组化法、免疫荧光法等方法，以及以分子生物学为基础的检测方法，如PCR、套式PCR和竞争PCR等。但这些方法都存在这样那样的缺点：病毒分离耗时、原位杂交操作繁琐等，PCR虽然有较高的特异性和敏感性，但容易出现假阴性结果，而且不能定量，往往漏检隐性感染的动物，造成疾病的蔓延。TaqMan探针方法能够定量，但成本较高，不利于推广。

发明内容

本发明要解决的技术问题是CSFV、PCV2与PRV的PCR检测方法易出现假阴性结果，而且不能定量，提供一种CSFV、PCV2与PRV多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物及检测方法。

本发明的技术方案是：CSFV、PCV2与PRV多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物：

CSFV引物的序列如下：

上游引物P1：5′-AAACGGAGGGACTAGCCGT-3′；

下游引物P2：5′-TGCCATGTACAGCAGAGA-3′；

PRV引物的序列如下：

上游引物P3：5′-CTCGCCATCGTCAGCAA-3′；

下游引物P4：5′-GCTGCTCCTCCATGTCCTT-3′；

PCV2引物的序列如下：

上游引物P5：5′-GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3′；

下游引物P6：5′-CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3′。

所述引物检测CSFV、PCV2与PRV的多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测方法，包括提取病毒的DNA后，按如下SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测，所述SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份：

所述反应条件为：95℃预变性1min；进入循环，95℃变性10s，58℃退火15s，72℃延伸15s，40个循环，循环结束后升温至95℃15s，再降至65℃15s，开始从65℃递增至94℃，采集荧光信号得出扩增产物的溶解曲线，于95℃15s结束反应。

本发明的有益效果是：本发明分别设计扩增CSFV、PCV2和PRV的特异性引物，建立了能够同时检测CSFV、PCV2和PRV的三重SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法。本发明利用TM值来区分不同的核酸片段，核酸片段的TM值主要与GC含量、序列长度和结构有关。CSFV的扩增片段基因序列长252bp，其TM值较高，达到了89℃以上；PCV2扩增片段长171bp，TM值比CSFV的低，在85℃左右；PRV的扩增片段为187bp，GC含量相对最高，TM值比CSFV、PCV2的TM值都高，达到92℃以上，CSFV、PCV2和PRV的TM值可以很好的区分。

在本发明中，CSFV扩增片段的TM值、PCV2扩增片段的TM值和PRV扩增片段的TM值会在一定的温度范围变动，CSFV的TM值变化范围为89.6-90.0℃，PCV2的TM值变化范围为85.2-85.7℃，PRV的TM值变化范围为92.6-93.0℃，3种病毒的TM值相差较大，借此可以利用熔解曲线的三个特异性的峰对这3种病毒进行鉴别。

本发明通过猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒三重SYBR Green Ⅰ定量PCR检测方法，能够同时检测CSFV、PRV和PCV23种DNA病毒，能最少检测183拷贝猪瘟病毒、231拷贝猪伪狂犬病毒和203拷贝猪圆环病毒2型；本发明的特异性试验结果良好，只出现三个特异性的峰值，重复性试验具有很好的稳定性，为有效检测和鉴别混合感染提供了一种成本低、快速、灵敏、特异、准确的新方法，有利于妊娠母猪繁殖障碍性病毒的鉴别。