[发明专利]使用羟磷灰石层析除去高分子量聚集体

说明书

本申请是申请号为200480038753.6(国际申请号为PCT/US2004/032883)、申请日为2004年10月6日、发明名称为“使用羟磷灰石层析除去高分子量聚集体”的中国专利申请的分案申请。

本申请要求2003年11月20日申请的美国临时专利申请号60/523,335和2003年10月27日申请的美国临时专利申请号60/514,018的优先权的利益，它们的公开内容在此全部引入作为参考。

发明领域

本发明涉及使用羟磷灰石层析从抗体制剂中除去高分子量聚集体的方法。在本发明的某些实施方案中，最终制剂中存在的高分子量聚集体的量可以显著降低，如从40％至小于1％。

背景技术

期望鉴定不含破坏或显著降低蛋白生物活性的纯化蛋白的有用方法。在抗体制剂用于诊断应用、治疗应用、应用细胞生物学和功能研究之前，必须从它们中除去污染物。例如，从杂交瘤细胞系收获的抗体制剂常常含有不需要的组分，如由细胞系制备的抗体的高分子量聚集体(HMWA)。这种聚集体的形成通过施用后引起补体激活或过敏性，可以不利地影响产物安全。此外，聚集体形成通过引起产物产量降低、峰加宽和活性丧失可以阻碍制造过程。

最常见的蛋白纯化方法以待纯化的蛋白和污染物之间在大小、电荷和可溶性上存在差异为基础。基于这些参数的方案包括亲和层析、离子交换层析、大小排阻层析和疏水作用层析。然而，这些层析方法在分离聚集或多聚种类的抗体中有时存在技术困难。例如，诸如离子交换和疏水作用层析的技术可以诱导聚集体形成，这是由于蛋白浓度增加或洗脱过程中所需缓冲液浓度和/或pH的改变。此外，几种情况下，抗体显示出太小的等电点差异，以至于不允许用离子交换层析分离它们。Tarditi，J.I mmunol.Methods 599：13-20(1992)。大小排阻层析麻烦且引起产物显著稀释，它是大规模、基于效率的制造方法中的障碍。配体从亲和层析柱泄漏也可能发生，它引起洗脱产物不合需要的污染。Steindl，J.Immunol.Methods 235：61-69(2000)。申请人企图使用阴离子交换层析、阳离子交换层析以及疏水作用层析从抗GDF-8抗体制剂中除去HMWA。然而，所有这些方法基本上不能从抗GDF-8抗体制剂中除去HMWA。

羟磷灰石层析是利用不溶的羟基化磷酸钙[Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂]纯化蛋白的方法，不溶的羟基化磷酸钙形成基质和配体。功能基团由正电荷钙离子(C位点)对和负电荷磷酸根基团(P位点)簇组成。羟磷灰石和蛋白之间的相互作用是复杂和多模式的。然而在相互作用的一个方法中，蛋白上的正电荷氨基与负电荷P位点结合，且蛋白羧基通过配位络合至C位点而相互作用。Shepard，J.of Chroma tography 891：93-98(2000)。

结晶羟磷灰石是用于层析的第一种羟磷灰石类型，但是它被结构难点所限。开发了陶瓷羟磷灰石(cHA)层析来克服与结晶羟磷灰石相关的一些困难，如有限的流速。陶瓷羟磷灰石具有高耐用性、蛋白结合力好和可以在比结晶羟磷灰石更高的流速和压力使用。Vola等人，BioTechniques  14：650-655(1993)。