[发明专利]一种利用毕赤酵母基因调控发酵生产不同分子量透明质酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和生物发酵领域，具体讲是利用毕赤酵母基因调控发酵生产不同分子量透明质酸的方法。

背景技术

透明质酸(HA)是由N-己酰氨基葡萄糖及D-葡萄糖醛酸的重复结构组成的线形多糖结构。HA在润滑关节，调节血管壁的通透性，促进创伤愈合等方面作用显著。尤为重要的是，它具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质之一。

但因HA的分子量较大，涂于表皮不会被真皮吸收，使其作用效果大大降低。而低分子量的HA寡糖(1×10⁵～4×10⁵)能渗透到真皮层，可调节皮肤代谢，促进血液循环，有保健、美白作用。此外，低分子量HA寡糖还具有促血管生成，促进创伤愈合及抑制血管新生内膜增生等作用。因此不同分子量的HA各有其重要作用，现在不同分子量HA的生产制备技术已引起极大重视。

不同分子量HA的制备方法有发酵法、生物合成法、化学降解法和酶解法。发酵法是通过控制发酵条件和分离精制条件来得到不同分子量的HA，但是分子量范围比较大，且很难得到分子量小于一万的HA。生物合成法反应条件要求极为严格，并且需要多种酶同时参与反应，成本较高。化学降解法是利用强酸、强碱或氧化剂等，反应条件较剧烈，能破坏HA糖链上的糖苷键，从而破坏HA的结构。酶降解法反应条件温和，降解速度快，较适于制备不同分子量HA，但是需要先制备酶液，再利用酶液降解HA。现多采用真核表达系统表达生产目标酶类，通过降解HA来生产制备不同分子量的HA及HA寡糖，具有产量高、安全、简便等优点。

发明内容

本发明利用真核表达系统——毕赤酵母表达系统分别表达透明质酸合成酶(HAS，一种主要在透明质酸合成过程中起作用的酶)和透明质酸酶(HAase，一种主要在将HA催化降解为不同分子量HA过程中起作用的酶)，并在发酵过程中直接生成多种不同分子量的HA。该方法实现了透明质酸分子量与基因调控方式的偶联，可以根据需要制备特定分子量的HA，是一种安全、简便、有效的方法。

本发明的目的是得到一种重组毕赤酵母通过基因调控直接生产特定分子量HA的新方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种重组毕赤酵母基因工程菌HAS-PH20，构建过程为：首先将兽疫链球菌透明质酸合成酶表达载体pGAPZαA-szHasA转入酵母菌中，得到重组酵母HAS，再将重组人透明质酸酶表达载体pPICZαA-ph20转入重组酵母HAS，即得到目的重组酵母HAS-PH20。

本发明提供了一种在发酵罐中，通过调节甲醇的流加速率、流加时间和甘油甲醇的体积比，用酵母基因工程菌HAS-PH20生产不同分子量的HA寡糖的新型发酵方法。

本发明提供的毕赤酵母基因工程菌HAS-PH20及不同分子量HA的发酵生产工艺，解决了目前HA生产过程中分子量分级困难的问题。

附图说明

图1：兽疫链球菌透明质酸合成酶酵母表达载体pGAPZαA-szHasA的构建过程图。

图2：重组人透明质酸酶酵母表达载体pPICZαA-ph20的构建过程图。

图3：发酵液中所得的不同分子量HA的纯化分析图。

具体实施方式

实验条件

1 菌株与载体

毕赤酵母菌株及大肠杆菌菌株TOP10为本实验室保存；毕赤酵母表达载体pGAPZαA及pPICZαA购自Invitrogen公司。

2 酶及其它试剂

本发明所用到的各种限制性内切酶均购自TaKaRa公司，pfu DNA聚合酶及Taq DNA聚合酶购自Fermentas公司；其它试剂均为国产试剂。

3 培养基

毕赤酵母发酵培养基为Basal Salts培养基(85％磷酸26.7mL/L，硫酸钙0.93g/L，硫酸钾18.2g/L，硫酸镁14.9g/L，氢氧化钾4.13g/L，甘油40g/L)；发酵过程中用到的微量盐溶液PTM1(硫酸铜6g/L，碘化钠0.08g/L，硫酸镁3.0g/L，钼酸钠0.2g/L，硼酸0.02g/L，氯化钴0.5g/L，氯化锌20.0g/L，硫酸亚铁20.0g/L，生物素0.2g/L，硫酸5mL/L)。

本发明所用到的重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。

实施例1：重组质粒pGAPZαA-szHasA及pPICZαA-ph20的构建和毕赤酵母转化

一 重组质粒pGAPZαA-szHasA的构建