[发明专利]一种利用毕赤酵母基因调控发酵生产不同分子量透明质酸的方法

权利要求书

1.一种通过基因调控直接生产特定分子量HA的毕赤酵母基因工程菌HAS-PH20。

2.权利要求1所述的毕赤酵母，其特征在于：该酵母细胞为毕赤酵母GS115、KM71或SMD1168。

3.权利要求1所述的酵母基因工程菌HAS-PH20，其特征在于：先将表达兽疫链球菌透明质酸合成酶的组成型重组质粒pGAPZαA-szHasA转化毕赤酵母，得到重组酵母菌HAS；再将表达重组人透明质酸酶的诱导型重组质粒pPICZαA-ph20转化重组酵母菌HAS，得到目标菌株HAS-PH20。

4.权利要求3所述的表达兽疫链球菌透明质酸合成酶的组成型重组质粒pGAPZαA-szHasA，其特征在于：该重组质粒是在GAP组成型启动子的调控下进行表达的，所述的兽疫链球菌透明质酸合成酶基因szHasA具有兽疫链球菌透明质酸合成酶碱基序列表中的碱基序列。

5.权利要求3所述的表达重组人透明质酸酶的诱导型重组质粒pPICZαA-ph20，其特征在于：该重组质粒是在AOX1诱导型启动子的调控下进行表达的；重组人透明质酸酶基因ph20是按照毕赤酵母偏好性设计的DNA分子，该分子的核苷酸序列所编码的氨基酸，与人透明质酸酶基因(gene ID6677)所编码的氨基酸完全相同。

6.权利要求5所述的根据毕赤酵母偏爱密码子设计的ph20基因序列，其特征在于：ph20基因序列是在人透明质酸酶基因(gene ID6677)基础上，利用P.pastoris偏爱密码子替换稀有密码子，对亮氨酸，脯氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，丝氨酸，丙氨酸等氨基酸的大多数密码子替换成以UUA，CCA，GAA，GAU，CAA，UCA，GCA，并敲除掉了Sac Ⅰ酶切位点，所述的ph20基因序列具有重组人透明质酸酶碱基序列表中的碱基序列。

7.权利要求1所述的毕赤酵母基因工程菌HAS-PH20发酵生产不同分子量HA的方法，其特征在于：

首先在30℃条件下，将重组酵母HAS-PH20用YPD培养基活化培养24小时；将过夜培养的酵母，按0.5％～2％的比例接种于YPD种子培养基中，上罐发酵方法如下：

(1)菌体培养阶段发酵温度保持在28～30℃，利用28％的氨水调节发酵培养基的pH值至5.0～6.0，然后将种子培养基按5％～10％的接种量接种入Basal Salts上罐培养基中，同时添加4.37mL PTM1盐溶液。通气搅拌18～24小时；

(2)甘油补料阶段组成型表达兽疫链球菌透明质酸合成酶并产生透明质酸阶段：流加30％～50％的甘油，流加量为10～20mL/hr/L，培养24～48小时左右，此时保证溶氧量大于20％。该过程既是酵母生长阶段即菌体湿重大量增加阶段，也是兽疫链球菌透明质酸合成酶组成型表达阶段，在此过程中透明质酸被快速积累；

(3)甲醇诱导阶段利用甲醇作为诱导剂诱导重组人透明质酸酶表达并将HA分解为不同分子量HA寡糖阶段：甘油流加一段时间后停止流加甘油，将碳源换为甲醇，流加速度为4～8mL/hr/L，再继续培养24～48小时，此过程保证溶氧量大于20％。该过程流加甲醇可诱导AOX1启动子作用并开始表达重组人透明质酸酶，在此过程中通过调节甲醇的流加速率、流加时间和甘油甲醇的体积比来获得不同分子量的HA寡糖。