[发明专利]斜纹夜蛾基因工程病毒3号及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种能够防治斜纹夜蛾等农林害虫的斜纹夜蛾基因工程病毒，属微生物技术领域。 

背景技术

斜纹夜蛾是农作物的主要害虫之一，我国各省区均有分布。该虫食性极广，已知可危害的寄主植物达99科290多种。近年来随着农业耕作制度的改变和城市化进程的快速发展，蔬菜、花卉、绿化草坪等旱地作物的种植面积越来越多，斜纹夜蛾的为害也日益猖獗。当前生产上采用的化学防治往往达不到预期效果，而且容易造成环境污染、农药残留和人畜中毒等。 

随着国民经济的不断发展和人民生活水平的日益提高，人们对于各种农产品的质量要求越来越高，特别是产品的安全性问题已受到广泛的关注和重视。目前，在各种农作物病虫害的防治工作中，过度依赖化学农药的情况仍然十分严重，由此带来了害虫抗性、再猖獗和环境污染等问题，直接影响到人类的食品安全和生存环境。因此，大力发展高效、广谱、与环境相容性好的无公害生物农药是农业可持续发展的需要。 

斜纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒(Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus，以下简称野生型病毒或SpltMNPV)已用于斜纹夜蛾的防治。但由于它存在杀虫速度慢的缺陷，影响了其推广应用。为了改变野生型昆虫杆状病毒杀虫速度慢的缺陷，上世纪90年代以来，国内外已有多种重组昆虫杆状病毒问世，如文献报道了美国的重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(rAcMNPV Stewart L M D et al 1991.Nature,352:85-88)、中国发明专利（CN 1109105C）公开的重组棉铃虫核型多角体病毒(rHaSNPV )等。但迄今为止，国内外尚未见插入昆虫神经毒素基因的斜纹夜蛾核型多角体基因工程病毒构建成功。 

发明内容

本发明的目的是提供一种能有效提高野生病毒杀虫速度和效果的斜纹夜蛾核型多角体基因工程病毒及其构建方法。 

本发明的目的是按下述方案实现的： 

一种斜纹夜蛾基因工程病毒，对野生型病毒SpltMNPV  进行缺失和重组得到，其保藏信息为：保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2011年5月20日；保藏编号：CCTCC NO:V201116；分类命名：斜纹夜蛾基因工程病毒3号(SpltMNPV-Δegt-Pph-egfp-Pie-1-BmK ITa1)；在其基因组中缺失了egt基因即蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因，在缺失egt基因的位点处，插入由野生型病毒即早期基因（ie-1）启动子控制的东亚钳蝎毒BmK ITa1基因和由野生型病毒多角体蛋白基因ph启动子控制的标记基因即增强型绿色荧光蛋白egfp基因。

提供一种构建上述基因工程病毒的方法，包括以下步骤： 

（1）构建重组质粒 pSK-Δegt-Pph- egfp   

以具有毒力的野生病毒 (Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus , SpltMNPV , GenBank 登录号：NC-011616 ) SpltMNPV  DNA为模板，分别扩增出同源重组臂egt上游非编码端序列Egt up和 egt 3′端的1055bp序列以及下游非编码端序列Egt down；扩增产物回收纯化后分别经Kpn I /Xho I， Xba I/ Sac I双酶切后依次克隆到载体pBluescript Ⅱ SK(+)上，获得中间质粒pSK- Egtup- Egtdown；

在上述两个片段之间，利用分子克隆技术插入SpltMNPV 多角体蛋白基因启动子启动Pph控制的增强型绿色荧光蛋白基因egfp，获得重组质粒 pSK-Δegt-Pph- egfp；

（2）构建重组转移载体pSK-Δegt-Pph- egfp-Pie-1- BmK ITa1