[发明专利]斜纹夜蛾基因工程病毒3号及其构建方法

权利要求书

1. 一种斜纹夜蛾基因工程病毒，其特征是对野生型病毒SpltMNPV                                                 进行缺失和重组得到的斜纹夜蛾基因工程病毒3号，其保藏信息为：保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏编号：CCTCC NO:V201116；分类命名：斜纹夜蛾基因工程病毒3号(SpltMNPV-Δegt-Pph-egfp-Pie-1-BmK ITa1)；在其基因组中缺失了egt基因即蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因，在缺失egt基因的位点处，插入由野生型病毒即早期基因 ie-1启动子控制的东亚钳蝎毒BmK ITa1基因和由野生型病毒多角体蛋白基因ph启动子控制的标记基因即增强型绿色荧光蛋白egfp基因。

2. 一种构建如权利要求1所述的斜纹夜蛾基因工程病毒3号（SpltMNPV-Δegt-Pph-egfp-Pie-1-BmK ITa1）的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）构建重组质粒 pSK-Δegt-Pph- egfp   

以SpltMNPV  DNA为模板，分别扩增出同源重组臂egt上游非编码端序列Egt up和 egt3′端的1055bp序列以及下游非编码端序列Egt down；扩增产物回收纯化后分别经Kpn I /Xho I， Xba I/ Sac I双酶切后依次克隆到载体pBluescript Ⅱ SK(+)上，获得中间质粒pSK- Egtup- Egtdown；

在上述两个片段之间，利用分子克隆技术插入SpltMNPV 多角体蛋白基因启动子启动Pph控制的增强型绿色荧光蛋白基因egfp，获得重组质粒 pSK-Δegt-Pph- egfp；

（2）构建重组转移载体pSK-Δegt-Pph- egfp-Pie-1- BmK ITa1

 在BmK ITa1基因前引入AcMNPV BV膜融合蛋白GP64的同系物，SpltMNPV  F蛋白的信号肽signalP序列，以SpltMNPV  DNA为模板，扩增出signalP序列，并克隆到pBacPAK8上得到pBacPAK8-signalP；将AcMNPV的即早期基因ie-1启动子克隆到pBacPAK8-signalP中，得到中间质粒pBacPAK8-Pie-1-signalP；

以pMD18-BmK ITa1为模板，PCR扩增出BmK ITa1片段并克隆到pBacPAK8-Pie-1-signalP中，得到pBacPAK8-Pie-1-signalP- BmK ITa1；

以Sma I和Xba I双酶切，切下Pie-1-signalP- BmK ITa1片段并插入到pSK-Δegt-Pph-egfp 中egfp基因和egt3’非编码端之间，得到重组转移载体pSK-Δegt-Pph- egfp-Pie-1- BmK ITa1；

（3）共转染、纯化，得到基因工程病毒SpltMNPV-Δegt-Pph-egfp-Pie-1-BmK ITa1

将Psk-Δegt-Pph-egfp-Pie-1-BmK ITa1和SpltMNPV 基因组DNA共转染斜纹夜蛾SpLi细胞，通过基因等位交换，获缺失egt基因的，以绿色荧光蛋白为标记的，病毒感染早期能表达BmK ITa1的重组病毒SpltMNPV-Δegt-Pph-egfp-Pie-1- BmK ITa1；

经多轮荧光斑法纯化，得到纯的重组斜纹夜蛾基因工程病毒3号(SpltMNPV-Δegt-Pph-egfp-Pie-1-BmK ITa1 )。