[发明专利]测定三聚氰胺含量的电化学免疫传感器及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于食品安全检测和分析化学技术领域，涉及一种三聚氰胺的检测装置和方法，具体地说是一种应用于测定食品和饲料中违禁添加物三聚氰胺的电化学免疫传感器及其制备方法，以及利用该传感器定量检测三聚氰胺含量的方法。

背景技术

三聚氰胺（Melamine）是一种重要的化工原料，常用于制造防火阻燃材料三聚氰胺树脂，也可用作减水剂和甲醛清洁剂等，在部分亚洲国家，还被用来制造化肥。由于牛奶和饲料工业常用的蛋白质含量检测方法“凯氏定氮法”，是通过测定含氮量来估算蛋白质含量，要求蛋白质平均含氮量为16 %左右，而三聚氰胺的含氮量约为66 %，因此三聚氰胺常被不法商人用作添加剂，以提升牛奶和饲料中的蛋白质含量指标，使劣质牛奶和饲料通过检验机构的检测。

研究表明，三聚氰胺能诱发动物肾衰竭并导致死亡。三聚氰胺在体内的代谢属于不活泼代谢或惰性代谢，即它在体内不会迅速发生任何类型的代谢变化。单胃动物以原体形式或同系物形式排出三聚氰胺，而不是代谢产物的形式。2008年发生的三聚氰胺毒奶粉事件，使得分析化学领域掀起了研究三聚氰胺检测方法的热潮，国内外开始对三聚氰胺及其检测产生高度关注。

三聚氰胺的传统检测方法有重量法、升华法等，但只限于对三聚氰胺原料的检测。近几年发展起来的方法有高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法、气相色谱质谱联用法、酶联免疫吸附法等。但是这些分析方法需要大型分析仪器，操作过程繁琐，前处理过程复杂，不能实现现场检测。

三聚氰胺的检测的方法中还包括电化学检测方法，如CN201020299766.1公开了一种用于快速检测三聚氰胺的修饰电极，包括：基底电极；设置于基底电极外表面的PDDA膜；以及设置于PDDA膜外表面的FDU膜。CN201010235974.X公开了一种用于三聚氰胺检测的碳纳米管修饰电极制备方法，将碳纳米管分散在DMF、四氢呋喃、甲醇、乙醇、水等溶剂中，再将此纳米管溶液和壳聚糖、Nafion、聚乙烯醇等粘合剂混合，分散均匀后将其涂在电极表面制成碳纳米管修饰电极。该电极能够检测三聚氰胺，最低检测限为10-13mol/L。CN200810234859.3披露了一种奶制品中三聚氰胺的电化学快速检测方法，其特征在于采用电化学法，以含碳的材料作为工作电极，将奶制品溶于酸性电解质溶液中，在较正的电位下作循环伏安扫描电解1～10分钟，根据所制得的伏安曲线，对奶制品中是否含有三聚氰胺进行初步定性分析和定量分析。所述检测方法，在灵敏度和特异性方面还有待进一步提高。

自上世纪80年代以来，生物传感器的研究与开发呈现出突飞猛进的局面，各类传感器应运而生。其中，与测定抗原抗体反应有关的传感器称为免疫传感器。抗原抗体结合前后可导致多种信号的改变，如在重量、光学、热学、电化学等方面。免疫传感器在检测三聚氰胺上已得到广泛应用，如各种基于抗体和抗原反应的用于三聚氰胺检测的免疫试剂（盒）。

由于电化学分析具有的以下特点和优势，如可以实现在体检测，不受样品颜色、浊度的影响（即样品可以不经处理，不需分离），且所需仪器设备相对简单，因此应用前景看好。

本发明旨在通过一种三聚氰胺检测的直接电化学生物免疫传感器的制备，建立一种检出限低、线性范围宽、灵敏度和特异性高、快速现场测定三聚氰胺含量的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种电化学免疫传感器及其制备方法，所述的传感器具有很高的灵敏度和专一性，可用于三聚氰胺检测。

本发明的另一目的还在于提供一种简单、快速、高效测定牛奶等食品中违禁添加物三聚氰胺残留量的检测方法。

实现本发明目的采用的技术方案如下：

一种检测三聚氰胺的电化学免疫传感器，包括基底电极，其特征在于所述的基底电极表面修饰石墨烯-三聚氰胺-壳聚糖复合物，并以牛血清蛋白封闭非特异性活性位点。 

所述的基底电极优选玻碳电极。

本发明的另一目的是提供一种所述免疫传感器的制备方法，技术方案如下：

一种检测三聚氰胺的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：将石墨烯的壳聚糖悬浮液超声分散后与三聚氰胺混合，将混合液滴涂在电极表面，利用壳聚糖将石墨烯和三聚氰胺包被并固定于电极表面，并将电极浸泡在牛血清蛋白（BSA）溶液中，封闭电极表面的非特异性的活性位点。

所述的基底电极优选玻碳电极。

所述的免疫传感器的制备，更具体和更优选的方法包括如下步骤：