[发明专利]测定三聚氰胺含量的电化学免疫传感器及制备方法和应用

权利要求书

1.一种检测三聚氰胺的电化学免疫传感器，包括基底电极，其特征在于所述的基底电极表面修饰石墨烯-三聚氰胺-壳聚糖复合物，并以牛血清蛋白封闭非特异性活性位点。

2.根据权利要求1所述的电化学免疫传感器，其特征在于，所述的基底电极为玻碳电极。

3.根据权利要求1或2所述的电化学免疫传感器，其特征在于，所述免疫传感器通过下述方法制得：将石墨烯的壳聚糖悬浮液超声分散后与三聚氰胺混合，将混合液滴涂在电极表面，利用壳聚糖将石墨烯和三聚氰胺包被并固定于电极表面，并将电极浸泡在牛血清蛋白溶液中，封闭电极表面的非特异性的活性位点。

4.根据权利要求2所述的电化学免疫传感器，其特征在于，所述免疫传感器通过下述步骤制得：

1）石墨烯-壳聚糖悬浮液的配制：将0.05M的HCl加热至80～90℃，加入称量好的壳聚糖，搅拌溶解，冷却后加入浓度为0.1M的NaOH，调节pH至5，配得1mg/mL的壳聚糖溶液；准确称取5g石墨烯样品于2mL壳聚糖溶液中，超声分散1h，制得石墨烯-壳聚糖悬浮液；

2）玻碳电极处理：直径为3mm的玻碳电极用分别用1.0和0.3μm的Al₂O₃粉乳液打磨抛光后，分别在乙醇和水中各超声清洗3min；

3）电极表面修饰：将4μL石墨烯-壳聚糖悬浮液与2μL浓度为0.2mg/mL的三聚氰胺水溶液混合，滴涂于步骤2）制得的玻碳电极表面，40℃下烘干30min；

4）非特异性的活性位点封闭：表面修饰后的电极于37℃下浸泡在5%的BSA溶液中30min，以封闭剩余的活性位点，制得所述的电化学免疫传感器。

5.一种检测三聚氰胺的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：将石墨烯的壳聚糖悬浮液超声分散后与三聚氰胺混合，将混合液滴涂在电极表面，利用壳聚糖将石墨烯和三聚氰胺包被并固定于电极表面，并将电极浸泡在牛血清蛋白溶液中，封闭电极表面的非特异性的活性位点。

6.根据权利要求5所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

1）石墨烯-壳聚糖悬浮液的配制：将0.05M的HCl加热至80～90℃，加入称量好的壳聚糖，搅拌溶解，冷却后加入浓度为0.1M的NaOH，调节pH至5，配得1mg/mL的壳聚糖溶液；准确称取5g石墨烯样品于2mL壳聚糖溶液中，超声分散1h，制得石墨烯-壳聚糖悬浮液；

2）玻碳电极处理：直径为3mm的玻碳电极用分别用1.0和0.3μm的Al₂O₃粉乳液打磨抛光后，分别在乙醇和水中各超声清洗3min；

3）电极表面修饰：将4μL石墨烯-壳聚糖悬浮液与2μL浓度为0.2mg/mL的三聚氰胺水溶液混合，滴涂于步骤2）制得的玻碳电极表面，40℃下烘干30min；

4）非特异性的活性位点封闭：表面修饰后的电极于37℃下浸泡在5%的BSA溶液中30min，以封闭剩余的活性位点，制得所述的电化学免疫传感器。

7.一种基于权利要求1所述的电化学免疫传感器检测三聚氰胺的方法，包括以下步骤：

1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的含有不同浓度游离三聚氰胺的pH为7.4的磷酸缓冲溶液为标准溶液，其中含有相同浓度的三聚氰胺抗体；

2）建立工作曲线：将免疫传感器分别浸入标准溶液中孵育，孵育后用磷酸缓冲溶液冲洗免疫传感器，在K₃[Fe(CN)₆]溶液中进行差分脉冲伏安（DPV）扫描，记录响应电流；空白标样的响应电流为I₀，含有游离三聚氰胺的标样的响应电流为I_x，响应电流的增加ΔI（ΔI=I_x-I₀）与标准溶液中三聚氰胺浓度C成正比，绘制ΔI-C标准曲线，或采用线性回归法得到ΔI-C线性回归方程；

3）三聚氰胺测定：将待测样品配制为含有与步骤1）相同浓度三聚氰胺抗体的磷酸缓冲溶液，按照与步骤2）相同的方法对免疫传感器进行孵育和差分脉冲伏安扫描，记录响应电流；根据响应电流的增加ΔI和标准曲线，得到三聚氰胺含量。

8.根据权利要求7所述的检测三聚氰胺的方法，其特征在于，所述的K₃[Fe(CN)₆]溶液的浓度为2 mM。