[发明专利]一种JC病毒的检测方法、其试剂盒及应用

权利要求书

1.一种JC病毒的检测方法，包括以下步骤：

首先针对JC病毒基因组设计特异性引物JCV-F和JCV-R，Taqman荧光探针JCV-P，Taqman荧光探针JCV-P的5’端标记有荧光基团，在除5’端外的任意一个位置上标记有淬灭基团，优选连接于3’端；

然后，处理待测样本，加入所述的特异性引物及探针进行PCR反应；

最后通过荧光定量PCR仪检测，得到反应结果；

其中，JCV-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；

JCV-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，或由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；

JCV-P的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，或由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的JC病毒的检测方法，其特征在于，所述的Taqman荧光探针的荧光报告基团选自由6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5或花菁5.5中的至少一种；

所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的至少一种；

3.根据权利要求2所述的JC病毒的检测方法，其特征在于，

当荧光淬灭基团选自4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、六氯-6-甲基荧光素、花菁3中的至少一种；

当荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯或六氯-6-甲基荧光素中的至少一种；

当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂1时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、六氯-6-甲基荧光素或花菁3中的至少一种；

当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂2时，荧光报告基团选自6-羧基四甲基罗丹明、花菁3、羧基-X-罗丹明或磺酰罗丹明中的至少一种；

当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂3时，荧光报告基团选自花菁5或花菁5.5中的一种；

优选的，所述荧光报告基团为6-羧基荧光素；所述荧光淬灭基团为黑洞淬灭剂1。

4.根据权利要求1所述的JC病毒的检测方法，其特征在于，步骤(2)中PCR反应的反应体系为：PCR反应液19.8μl、DNA聚合酶0.2μl和待检模板5.0μl；

其中，PCR反应液的组成为：10×反应缓冲液2.5μl，JCV-F(10μM)0.60μl，JCV-R(10μM)0.30μl，JCV-P(10μM)0.70μl，dNTP3.0μl，最后用无菌超纯水将反应体系补至19.8μl。

5.根据权利要求1所述的JC病毒的检测方法，其特征在于，步骤(2)中PCR反应的反应条件为：92～95℃保温3～5分钟后；92～95℃，10～15秒，55～65℃，10～35秒，共35～45个循环；优选为：94℃保温4分钟后；94℃，15秒，60℃，35秒，共40个循环。

6.根据权利要求1所述的JC病毒的检测方法，其特征在于，步骤(2)中的PCR反应中，还设置阴性质控组和JC病毒定量标准品I～IV组；其中，阴性质控组的待测模板为纯水，JC病毒定量标准品I～IV的待测模板分别为JCV定量标准品I、JCV定量标准品II、JCV定量标准品III、JCV定量标准品IV。