[发明专利]一种呼吸道合胞病毒F2蛋白亚单位疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种呼吸道合胞病毒F2蛋白亚单位疫苗及其制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus, RSV）是引起婴幼儿患毛细支气管炎、肺炎、支气管炎的主要病原体之一，可导致婴幼儿的死亡。免疫缺陷病人及老年人也是RSV的易感人群。自病毒发现以来，虽对RSV研究取得一定进展，但目前只有两种单抗批准上市，以治疗患病严重的患者。而一种有效、完全安全的RSV疫苗并未问世。世界卫生组织(WHO)已将RSV 疫苗列为全球疫苗发展计划中优先发展的疫苗之一。

然而60年代使用的RSV灭活疫苗虽可诱导中和抗体的产生，但疫苗使用后增强了婴幼儿后继感染野毒株RSV的发病程度，甚至引发死亡。随后的RSV的减毒活疫苗会导致上呼吸道的轻微至中度充血，且免疫原形差、遗传性不稳定。目前研制的RSV亚单位疫苗被认为是相对安全的，并不存在毒力返祖与免疫原性低下等问题。RSV囊膜上的膜融合（F）和粘附(G)糖蛋白均可诱导机体产生中和抗体。但相比较而言，G蛋白倾向于体液免疫，而F蛋白既可诱发体液免疫也可以诱发一定的细胞免疫，且氨基酸序列相对保守。所以在SRV的保护性抗原中，F蛋白比G蛋白更重要。

但目前基于F蛋白相关的疫苗，难以在原核表达系统获得表达，完全依赖于细胞培养获得。其对环境要求较高，且成本昂贵，不利于疫苗的普及。F2肽段是决定RSV感染的宿主细胞特异性的唯一因素。目前已通过小鼠模型确定了2个位于F2区的CTL识别位点AA85-93和AA92-106，其次，AA51-65也是重要的T细胞识别表位。本发明选择通过原核表达系统融合表达F2蛋白，再通过酶切获得纯度较高的非融合的F2蛋白。 

因此，本发明用F2蛋白免疫机体，开发一种有效的呼吸道合胞病毒亚单位疫苗。

发明内容

本发明提供了一种呼吸道合胞病毒F2蛋白亚单位疫苗，旨在能刺激机体产生较好的免疫应答，用于人体或动物预防接种，抵抗呼吸道合胞病毒的感染，F2蛋白是由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列所编码或具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明另一目的在于提供一种呼吸道合胞病毒F2蛋白亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤：

（1）重组表达载体F2/pFN18K的构建

以F/pMD18T质粒为模板，PCR扩增获得F2基因，并引入NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点和6×His标签，F2基因经NcoⅠ和BamHⅠ双酶切后得到带有粘性末端的目的基因，并与同样双酶切过的大肠杆菌表达载体pFN18K相连接，形成重组表达载体F2/pFN18K；

（2）F2蛋白的诱导表达及其纯化

重组表达载体F2/pFN18K转化到大肠杆菌表达菌株中，形成重组工程菌，重组工程菌经过发酵培养，采用鼠李糖诱导表达Halo-F2融合蛋白；经诱导的重组工程菌采用超声破菌，4℃下2000rpm离心10分钟后，用梯度透析方法对Halo-F2融合蛋白复性，复性后的蛋白在4℃下，透析至烟草蚀斑病毒蛋白酶（TEV）反应液中，每1mg Halo-F2融合蛋白加入10U TEV酶，酶切反应8h-12h，酶切后的蛋白经过层析纯化，得到疫苗蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的方法中大肠杆菌表达载体为质粒pFN18K及其衍生质粒、以及适用于大肠杆菌系统的含HaloTag^?7或脱卤素酶的遗传修饰衍生物与TEV酶切位点系列的表达载体，如pFN6K、pFC14A等。

本发明所述的方法中大肠杆菌表达菌株为KRX菌株及其它E. coli K细胞株。

本发明所述的方法中转化大肠杆菌表达菌株的方法为热休克转化法，电转化法或原生质体转化法。

本发明所述的方法中采用金属离子亲和层析纯化法或离子交换层析法纯化蛋白。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

在大肠杆菌中原核表达F2蛋白，可以提高蛋白疫苗的表达水平，由于大肠杆菌结构简单、生长快速、易于培养和发酵、生产成本低、目的蛋白产量高，这对于规模化生产及其临床应用具有重要的现实意义。

 

附图说明

图1是PCR扩增获得F2基因电泳图。（1：DNA Marker 2K plus；2：F2目的基因片段）。