[发明专利]去细胞异种角膜基质载体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种去细胞异种角膜基质载体及其制备方法和应用。

背景技术

据1991年WHO统计，世界上约有角膜病和眼外伤角膜致盲者1000万人，每年新增病例约150万到200万。在我国，共有约400万角膜病盲人。角膜移植术是角膜病致盲患者唯一的复明手段。由于角膜供体材料匮乏，目前，我国每年仅能做角膜移植手术的不足1％。因此，如何获取适用的角膜移植材料成为眼科界亟待解决的问题。

随着组织工程学的发展，人工生物角膜的研究已成为当今国内外眼科学研究的热点。从临床应用的角度，组织工程化角膜并不一定需要具有全部三层结构，有时仅需要板层或单纯的角膜上皮、基质或内皮组织。目前利用自身或同种异体角膜上皮干细胞重建眼表的相关研究相对较多，其成功构建的难点在于寻找合适的载体。

关于干细胞载体，国内外研究最多的是羊膜，它存在完整的基底膜和细胞外基质，具有良好的组织相容性、抗炎和抗新生血管的作用。但羊膜相对较薄，厚度仅20μm～100μm，如长时间在羊膜表面培养细胞，细胞生长不均匀，易脱落，始终不能完全透明，还存在潜在的HIV感染等危险。这些都影响了以羊膜为载体进行干细胞移植的研究和临床应用。因此期望选择更为理想的载体代替羊膜。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种胶原排列整齐，与正常角膜组织相似，复水后透明性好的去细胞异种角膜基质载体。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种去细胞异种角膜基质载体，其特征在于，该载体是经高渗溶液联合酶消化法去除上皮细胞及基质细胞后的动物板层角膜；该载体的制备方法包括以下步骤：

(1)动物眼球的摘取和保存：摘取动物眼球，用生理盐水冲洗眼球，将冲洗后的动物眼球置于湿房中，4℃～8℃保存，24小时内进行板层角膜的剖切；

(2)板层角膜的剖切：用生理盐水和含400U/mL妥布霉素的生理盐水交替冲洗步骤(1)中保存的动物眼球，然后在手术显微镜下无菌操作，用直径5mm～12mm的刻度环钻钻取150μm～400μm厚的板层角膜；

(3)高渗溶液联合酶消化法去除板层角膜上皮细胞及基质细胞：

301、将步骤(2)中所述板层角膜放入高渗溶液中，在温度为25℃～40℃条件下浸泡1天～3天；所述高渗溶液为质量浓度3％～20％的NaCl水溶液；

302、将301中浸泡后的板层角膜取出后放置于含胰酶的缓冲溶液中，在温度为25℃～40℃条件下浸泡1天～4天，所述含胰酶的缓冲溶液中胰酶的质量百分含量为0.05％～0.35％；或者将301中浸泡后的板层角膜取出后放置于胰酶替代物中，在温度为25℃～40℃条件下浸泡1天～4天；所述缓冲溶液为D-Hanks溶液，所述胰酶替代物为TrypLE Express；

303、将302中浸泡后的板层角膜取出后用去离子水洗涤3次，得到去细胞异种角膜基质载体；

(4)干燥处理：将303中所述去细胞异种角膜基质载体置于无菌平皿中，然后一同放入装有干燥剂的干燥器中，密封，室温下干燥脱水1天～3天，所述干燥剂为无水氯化钙；

(5)消毒处理：将步骤(4)中干燥后的去细胞异种角膜基质载体置于无菌瓶中，密封，然后采用Co 60辐射进行消毒处理，辐射照射总剂量为25kGy；

(6)保存：将步骤(5)中经消毒处理后的去细胞异种角膜基质载体在室温条件下常规保存，备用。

上述的去细胞异种角膜基质载体，所述动物为猪、牛或鸵鸟。

本发明还提供了上述去细胞异种角膜基质载体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)动物眼球的摘取和保存：摘取动物眼球，用生理盐水冲洗眼球，将冲洗后的动物眼球置于湿房中，4℃～8℃保存，24小时内进行板层角膜的剖切；

(2)板层角膜的剖切：用生理盐水和含400U/mL妥布霉素的生理盐水交替冲洗步骤(1)中保存的动物眼球，然后在手术显微镜下无菌操作，用直径5mm～12mm的刻度环钻钻取150μm～400μm厚的板层角膜；

(3)高渗溶液联合酶消化法去除板层角膜上皮细胞及基质细胞：

301、将步骤(2)中所述板层角膜放入高渗溶液中，在温度为25℃～40℃条件下浸泡1天～3天；所述高渗溶液为质量浓度3％～20％的NaCl水溶液；