[发明专利]一种绵羊支原体肺炎抗性基因型的筛选方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物检测技术领域，具体说是涉及一种绵羊支原体肺炎抗性基因型的筛选方法。

背景技术：

绵羊支原体性肺炎又称绵羊传染性胸膜肺炎的病原，是一种由绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae，MO)所引起的以咳嗽、喘气、渐进性消瘦以及肺间质增生性炎症为特征的呼吸道疾病，本病的直接损失是羔羊死亡率增加、疾病监测治疗的费用提高；间接损失主要是疾病的慢性营养消耗、体重减轻、上市推迟、繁殖力降低等。因此从抗病育种的角度，通过研究MBL基因多态性与疾病的相关性，采用PCR-SSCP技术研究其MBL基因外显子和内含子的遗传多态性，并统计分析MBL基因不同的基因型与湖羊血清MBL水平的相关性，寻找抗性型与易感型个体，为研究绵羊MBL基因的多态性与疾病的关系奠定坚实的基础，对合理开发利用新疆地方绵羊品种遗传资源以及引进新品种具有重要的现实意义；

MBL存在于人及动物的血液和肝脏组织中，是一种重要的天然免疫防御分子，MBL能直接介导调理吞噬作用或通过MBL途径激活补体，在机体先天性免疫防御、免疫监视和免疫复合物清除中起重要作用。MBL生物学功能的实现有赖于其完整的蛋白质结构，MBL结构基因突变影响了蛋白多聚体的功能性和稳定性，使得MBL血清浓度明显降低，机体的免疫防御和监视能力削弱，导致机体对多种病原的易感。研究表明编码区上游(主要是外显子1、2)的点突变则会影响血清MBL检测浓度，而内含子区域的突变可能影响转录，导致功能区翻译不全，使得MBL的蛋白质结构发生变化，因此MBL基因外显子和内含子的多态性与MBL的表达水平具有一定的相关性，为进一步选育绵羊支原体肺炎抗性基因型个体奠定实验基础。

发明内容：

本发明的目的是以常发病绵羊支原体肺炎为疾病模型，实验证实该病与MBL多态性及血清水平有相关性，并提供绵羊MBL基因与MBL水平相关的21种基因型和各自的突变位点，分析了绵羊MBL基因外显子1、4和内含子1、2的多态性，通过测序找到他们的突变位点，并经过EILSA检测发现这些位点的突变对绵羊支原体肺炎的抗性是有意义的，最后用人工感染的方法进行了验证的一种绵羊支原体肺炎抗性基因型的筛选方法，以克服上述不足。

本发明的目的是由以下技术方案实现的：

一种绵羊支原体肺炎抗性基因型的筛选方法，其特征是：绵羊支原体肺炎抗性基因多态性分析及筛选，具体筛选包括以下方法：

(1)样品采集和绵羊基因组DNA的提取；

(2)对MBL外显子1和4、内含子1和2逐段进行多态性分析，设计了7对引物，进行PCR扩增，筛选出与MBL水平相关的基因型21种，其中外显子1上有4种基因型，即AA、BB、CC和BC型，含5个突变位点，分别位于第27、41、43、83、105位点，其中g.27T＞C和g105C＞T为同义突变，g41T＞A(Val14 Glu)，g43G＞A(Val15 Met)，g83A＞G(Glu28 Gly)3处为错义突变；外显子4上有3种基因型，即GG、GH和HH型，含5个突变位点，分别位于第3235、3243、3257、3331、3334位点，其中g.3235T＞C，g.3331C＞T，g.3334C＞T为同义突变，g.3243A＞G(Glu 181 Gly)，g.3257G＞A(Gly 186 Ser)2处为错义突变；内含子1上有3种基因型，含AA、BB、AB型，1个突变位点，位于第288位点；内含子2上有11种基因型，包括PP、OP、CC、CD、DD、EE、EF、FF、GG、GH、HH型，含3个突变位点，分别位于第1091、1096、1784位点，均为同义突变位点；

(3)进行绵羊支原体肺炎EILSA抗体水平检测，以外显子1的多态性分析为基础，对同一基因型绵羊支原体肺炎阴性和阳性不同个体进行差异显著性分析，筛选出绵羊支原体肺炎抗性基因型和易感性基因型；

(4)以外显子1的多态性分析为基础，筛选出中国美利奴羊四种不同MBL基因型，即BB型、BC型、CC型和DD型各9只，建立供试群体，EILSA检测群体MBL水平，结果显示CC型MBL血清水平最高，BB、BC次之，DD型MBL血清水平最低，预测CC型为抗性组，DD型为易感组，人工感染绵羊肺炎支原体，结果抗性组中发病2只，未发病7只；易感组中发病7只，未发病2只，对照组均未发病，BC组中发病5只，未发病5只；BB组中发病5只，未发病4只，表明抗性组绵羊支原体肺炎的感染率显著低于易感组。

本发明的优点是：