[发明专利]一种检测CCR5-Δ32基因突变的方法及引物

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学诊断和生物技术，具体的是通过设计一组特异性引物，建立一种利用PC R扩增产物的条带数目判断CCR5-Δ32基因突变类型的方法。 

背景技术

病毒特异的CD4+T细胞是针对HIV免疫应答的重要组成部分，也是HIV-1感染过程的首要靶点。但是仅有CD4分子并不能介导HIV-1的侵入，同时还需要一种或几种辅助受体。趋化因子是一类具有趋化活性的小分子细胞因子，它的功能在于使细胞表面具有跨膜G蛋白偶联受体的细胞聚集在一起，参与体内的免疫平衡作用。1996年证实，趋化因子受体CXCR4和CCR5是HIV-1感染的辅助受体(coreceptor)。几乎所有的HIV-1病毒株都是利用其中的CCR5或CXCR4受体，或同时利用两种辅助受体侵入细胞。研究表明，CCR5和CXCR4的N末端和第二胞外区对于它们与HIV-1gp120的结合起着关键的作用。 

CCR5是细胞内β趋化因子(RANTES、MIP-1α和MIP-β)的受体，具有调控T细胞和单核细胞/巨嗜细胞系的迁移、增殖与免疫的功能，主要表达于记忆性的静止期T淋巴细胞、单核细胞、未成熟的树突状细胞等的细胞膜上。它的分子量为40.6kDa，由352个氨基酸残基组成，结构上可分为：胞外N末端，3个胞外环(EL1-3)，3个胞内环(IL1-3)，7个跨膜α螺旋和胞内C末端。 

在CCR5基因中存在的多个突变体能够有效抵抗HIV的病毒感染以及延缓病情的恶化。目前已在此基因的编码区和启动子区域发现了多种有意义的突变，尤其以对基因编码区突变体CCR5-Δ32的研究最为广泛，CCR5-Δ32是指CCR5基因的32个碱基缺失的突变，即在CCR5等位基因编码区域第185位氨基酸密码子以后发生了32个碱基缺失(位于CCR5基因的3317～3348)，导致读码框架错位，缺失了与G蛋白信号通路相关的胞外第三环结构，从而使CCR5蛋白无法正常穿膜表达于细胞膜上，进而使HIV-1gp120不能与CCR5-Δ32有效结合，使HIV-1病毒不能进入宿主细胞。人群调查和实验研究结果表明，CCR5-Δ32缺失的个体拥有正常的免疫功能和炎症反应，并且对HIV-1的感染表现出显著的抵御能力。 

CCR5-Δ32造血干细胞移植是治疗HIV感染的基因治疗新方案：我们在2005年发表的有关利用CCR5突变治疗HIV感染和AIDS的论文中，对这一新 的基因疗法有如下描述：“就艾滋病患者而言，在治疗上，可将其视为再生障碍性贫血或白血病患者看待，通过移植对HIV具有一定抗性的CCR5-Δ32基因型骨髓，达到重建其免疫力的目的。由于异体造血干细胞移植存在两大弱点，即器官移植的排斥反应和CCR5-Δ32基因型骨髓来源的匮乏。因此，就HIV感染者而言，通过对其自身造血干细胞进行CCR5体外致突变，可在更大范围内受益于HIV感染者。”[1] 

2010年德国学者的临床研究部分证实了CCR5-Δ32异体基因型骨髓移植在HIV感染治疗中重要作用[2-3]。虽然CCR5-Δ32基因型异体骨髓移植的疗效尤其是这一新疗法对晚期AIDS的疗效还需更多病理和更长时间的验证，但《血液》杂志所报道的个案，仍表明基于CCR5-Δ32基因型的干细胞移植疗法在HIV感染治疗中所具有的里程碑式意义。 

利用干细胞移植治疗HIV感染，首先需要确定干细胞CCR5基因型，是否发生CCR5-Δ32基因突变。从技术角度来看，通过检测扩增片段长度来检测CCR5基因是否发生32个核苷酸缺失相对于DNA直接测序要来的简单的多。目前，限制性片段长度多态性(RFLP)技术是检测扩增片段长度的常用手段。限制性片段长度多态性(RFLP)技术是利用限制性内切酶能识别DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即产生限制性片段的特性，对于不同种群的生物个体而言，他们的DNA序列存在差别。如果这种差别刚好发生在内切酶的酶切位点，并使内切酶识别序列变成了不能识别序列或是这种差别使本来不是内切酶识别位点的DNA序列变成了内切酶识别位点。这样就导致了用限制性内切酶酶切该DNA序列时，就会少一个或多一个酶切位点，结果产生少一个或多一个的酶切片段。这样就形成了用同一种限制性内切酶切割不同物种DNA序列时，产生不同长度大小、不同数量的限制性酶切片段。后将这些片段电泳、转膜、变性，与标记过的探针进行杂交，洗膜，即可分析其多态性结果。但是RFLP技术也有一些明显的缺陷，如技术复杂，周期长，费用高；检测中需放射性物质，限制了广泛应用；检测多态性水平过分依赖限制性内切酶，使多态性降低；DNA量大，分析速度慢。