[发明专利]猪乙型脑炎病毒与猪细小病毒二联灭活疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪二联灭活疫苗，特别是指一种治疗和预防猪乙型脑炎和猪细小病毒感染的二联灭活疫苗，属于兽用疫苗领域。

背景技术

猪乙型脑炎病毒(Swine Japanese Encephalitis Virus，JEV)和猪细小病毒(Porcine Parvovirus Virus，PPV)是引起猪繁殖障碍的重要病原体之一，主要表现为母猪流产、不孕、产死胎、木乃伊胎及弱仔，公猪睾丸急性炎症反应或不育，使养猪业损失巨大。JEV和PPV除单独感染外，常常混合感染，对四川、重庆、湖北、河南等规模化猪场的混合感染调查，发现混合感染阳性率≥60％。

《猪细小病毒感染症-乙型脑炎二联油乳剂灭活疫苗研究》中，公开了将猪细小病毒灭活油乳剂单苗和猪乙型脑炎灭活油乳剂单苗等量混合获得的一种二联灭活疫苗，但实际上，该文献所提供是在猪细小病毒和猪乙型脑炎病毒的增殖过程中，分别使用了胎猪内脏和小鼠鼠脑，不仅增殖方法繁琐，且依赖于动物器官组织，不利于扩大生产；而且在病毒液中存在着大量的杂蛋白影响疫苗的安全性和稳定性，特别是容易引起动物的过敏反应。

中国专利的“猪细小病毒L株及在制备猪细小病毒病灭活疫苗中的用途”(CN 101851609A)、“猪细小病毒病油乳剂灭活疫苗”(CN1706497A)和“猪细小病毒病油乳剂灭活疫苗”(CN 1704119A)使用了转瓶培养的方式生产猪细小病毒。但这种转瓶培养的技术方案存在着一些与传统的转瓶培养所共有缺点：(1)转瓶细胞培养，不能对培养液的养分、pH及溶氧等培养条件进行实时调整，因此无法保证细胞处于最佳培养状态；(2)转瓶细胞培养，操作程序繁琐，有污染风险的暴露点多，生产工艺难放大；(3)转瓶细胞培养，批间差异大，生产质量难以控制，产品质量不稳定。

中国专利“应用生物反应器工业化生产猪乙型脑炎疫苗的方法”(CN 102038943A)和“应用生物反应器工业化生产猪细小病毒疫苗的方法”(CN 102038945A)使用了微载体生物反应器培养猪乙型脑炎病毒和猪细小病毒，进一步提高了生产的规模，但是由于用于增殖病毒的大多数传代细胞，如BHK-21或ST细胞等，均为动物细胞，细胞外层为质膜，脆性大，因此在反应器中应务必减少剪切力。而上述专利中病毒培养方式使用的为搅拌式生物反应器，这种搅拌式的培养方式所产生的高剪切力会导致细胞损耗率高，进而影响到生物反应器的生产效率及细胞产量，特别会形成不必要的细胞碎片，容易引起动物过敏反应，影响疫苗的质量。

因此，由于上述困难，目前市场上未有猪乙型脑炎病毒与猪细小病毒二联灭活疫苗的生产和销售，预防这两种病毒引起的疫病时，需单独接种JEV和PPV单苗，免疫程序复杂、成本较高。而且，由于二种病毒引起的疾病常常同时发生，单苗免疫效果也不尽如人意。因此，现实中迫切需要开发一种免疫性高、安全性好、免疫程序简便的猪乙型脑炎病毒与猪细小病毒二联灭活疫苗，特别是需要一种简单方便、工艺易于放大的二联灭活疫苗的制备方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的提供一种猪乙型脑炎病毒与猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法。

本发明以免疫原性好、生长稳定、效价高的猪乙型脑炎病毒与猪细小病毒为毒种，采用潮汐式生物反应器大规模生产JEV和PPV抗原，通过抗原浓缩工艺，辅以高效的进口疫苗佐剂，制备成猪乙型脑炎病毒与猪细小病毒二联灭活疫苗，至少克服了现有技术中的如下缺点：

(1)克服了传统疫苗毒株筛选中单纯的细胞适应方法，采用细胞适应、细胞克隆和病毒克隆纯化技术相结合，获得的毒种免疫原性好、生长稳定、效价高，制备的二联灭活在免疫抗体滴度、免疫持续期、疫苗保存期等方面优于目前市场使用的单苗。

(2)克服了传统的转瓶培养规模小、质量难控、操作繁琐的缺点，又克服了搅拌式生物反应器高剪切力引起的细胞损耗率高、疫苗质量受损的缺点。

(3)克服了猪场为预防猪乙型脑炎和猪细小病毒感染，需单独免疫JEV和PPV疫苗，简化了免疫程序，降低猪的临床应激反应，提高了疫苗的免疫效果。

技术方案

因此，本发明提供了一种猪乙型脑炎病毒与猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：

1)在潮汐式生物反应器中，接种动物细胞至生物反应器内的微载体上，进行细胞的吸附培养；

2)在细胞的吸附培养结束后进行细胞的扩增培养，将猪乙型脑炎病毒与猪细小病毒分别接种到扩增培养的细胞上，进行病毒的吸附培养；

3)在病毒的吸附培养结束后进行病毒的增殖培养；