[发明专利]猪乙型脑炎病毒与猪细小病毒二联灭活疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种猪乙型脑炎病毒与猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)在潮汐式生物反应器中，接种动物细胞至生物反应器内的微载体上，进行细胞的吸附培养；

2)在细胞的吸附培养结束后进行细胞的扩增培养，将猪乙型脑炎病毒与猪细小病毒接种到扩增培养的细胞上，进行病毒的吸附培养；

3)在病毒的吸附培养结束后进行病毒的增殖培养；

4)在接种的动物细胞病变CPE达到75％以上时，收获病毒液；

5)将收获的病毒培养液于-20℃冻融两次，浓缩后灭活，获得灭活的猪乙型脑炎病毒与猪细小病毒混合液；

6)进行水相与油相的配置：将猪乙型脑炎病毒与猪细小病毒混合液作为水相，加入乳化剂，乳化后获得猪乙型脑炎病毒与猪细小病毒二联灭活疫苗。

2.根据权利要求1所述的二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述微载体由选自聚酯、明胶或多糖的一种或几种制成。

3.根据权利要求1所述的二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述微载体以0.5×10⁶～5×10⁶cells/g的终密度接种细胞。

4.根据权利要求1所述的二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述微载体的添加量为40～80g/L。

5.根据权利要求1所述的二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述猪乙型脑炎病毒为SD-2011株，保藏号为V201119；所述猪细小病毒为HN-2011株，保藏号为V201118。

6.根据权利要求1所述的二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤2)中接种时的细胞浓度为0.5×10⁷～1.0×10⁸cells/g。

7.根据权利要求1所述的二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述猪乙脑病毒和猪细小病毒接种的感染复数为0.0001～1.5。

8.根据权利要求1所述的二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述的吸附培养和步骤2)中所述的扩增培养使用含3％～5％(V/V)牛血清的细胞培养液；步骤3)中所述的病毒吸附培养和步骤4)中所述的病毒增殖培养使用1％(V/V)牛血清的细胞培养液，其中所述的细胞培养液为选自DMEM、MEM、α-MEM、EMEM、1640、M199、F10和F12中的一种，所述的牛血清为胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。

9.根据权利要求1中所述的二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤1)至步骤2)的培养过程中控制葡萄糖含量范围为1.0～4.5g/L，温度37.0℃，pH调节7.0～7.5，溶氧调节40％～80％，二氧化碳浓度为5％～10％的条件下进行。

10.根据权利要求1中所述的二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤3)至步骤4)的培养过程中控制温度36.5℃，pH调节7.0～7.5，溶氧调节30％～80％，二氧化碳浓度为3％～5％的条件下进行。

11.根据权利要求1-10任一项制备方法获得的猪乙型脑炎病毒与猪细小病毒二联灭活疫苗。

12.根据权利要求11的二联灭活疫苗，其特征在于，所述猪乙型脑炎病毒为SD-2011株，保藏号为V201119；所述猪细小病毒为HN-2011，保藏号为V201118。

13.一种猪乙型脑炎病毒为SD-2011株，保藏号为V201119。

14.一种猪细小病毒为HN-2011，保藏号为V201118。