[发明专利]一种菊花CVB和CChMVd病毒的二重RT-PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学的病毒检测领域，具体地说涉及一种菊花CVB和CChMVd病毒的二重RT-PCR检测方法。

背景技术

菊花（Dendranthema morifolium Tzvel.(Chrysanthemum morifolium Ramat.)）为菊科菊属多年生宿根草本植物，是我国十大传统名花，世界上最早栽培的观赏植物之一，具有很高的经济和观赏价值，在花卉产业中占据重要的地位。菊花在移栽、扦插、以及种植过程中易感染病毒。菊花B病毒（Chrysanthemum virus B，CVB），使患病菊花在菊花叶上表现为轻型花叶症，而对于易感品种，可形成明显花叶症状或坏死斑，严重的会产生褐色枯斑。CVB于观赏菊花上普遍发生，发病率60~65%。菊花褪绿斑驳类病毒（Chrysanthemum chloritic mottleviroid，CChMVd）是为害菊花的另一种重要病原，引起菊花斑驳病。受害植株通常在叶上呈现斑驳状，后完全褪绿。有些品种则表现为生长迟缓矮化，生根不良。

以往检测植物病毒可用电镜负染色法进行检测和鉴定，但是负染色电镜方法对初学者来讲，难度比较大，不仅容易受到破碎细胞的干扰而影响判断结果，而且不能鉴定潜隐和复合侵染病毒。

随着现代植物病毒和类病毒检测手段的发展，目前运用最为广泛的是酶联免疫法（ELISA），在国外已经形成商品化生产，但是每种病毒都需要特异的酶标记特异抗体，标记过程比较复杂，价格比较昂贵，有时也会产生非特异性的颜色干扰，而且不能鉴定不含外壳蛋白的类病毒。

北京市农林科学院于2008年申请的中国专利“一种用于检测菊花B病毒的方法”（申请号：CN200810240415）和“一种用于检测菊花褪绿斑驳类病毒的方法”（申请号：CN200810240414）公开了采用分子生物学方法检测CVB和CChMVd的方法，但采用LAMP进行检测容易受到污染，出现假阳性结果，对引物设计的要求非常高。

目前对于菊花在CVB和CChMVd复合侵染下可同时检测出病原的技术未见报道，如果可同时检测出病原，可提高检测效率，显著降低检测成本。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种菊花CVB和CChMVd病毒的二重RT-PCR检测方法，可同时检测出CVB和CChMVd。

技术方案：为实现上述目的，本发明的一种菊花CVB和CChMVd病毒的二重RT-PCR检测方法，包括如下步骤：

（1）从菊花植株取样并提取总RNA；

（2）分别针对CVB和CChMVd病毒设计两对特异性引物：CVB-F，CVB-R；CChMVd-F，CChMVd-R；

（3）以随机六聚体为引物进行反转录得到两种cDNA； 

（4）利用RT-PCR技术扩增所述cDNA，将扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到665bp特异性片段表示感染CVB，得到206bp特异性片段表示感染CChMVd。

步骤（1）所述取样包括菊花植株的花、上部叶片、下部叶片，取样后将样本用液氮冷冻保存。所述提取总RNA采用Takara公司提供的RNA提取试剂盒，得到的总RNA保存于-70℃超低温冰箱。

步骤（2）所述两对特异性引物分别为：

CVB-F：5’-ACCGAATTCTTAGTCACAATGCCTCCC-3’，

CVB-R：5’-TCCGAGCTCATAGAGACGGCATACCTT-3’；

CChMVd-F：5’-CAGTTTCGGCTTGTGCGGGAGT-3’，

CChMVd-R：5’-TCCGAGGAGAATATCCAACGAG-3’。

步骤（4）所述RT-PCR反应体系25μl中包括0.5μl CVB-F，0.5μl CVB-R，0.5μl CChMVd-F，0.5μl CChMVd-R。具体的说，所述RT-PCR反应在25μl的反应体系中还加入：1μl dNTPs（2.5mmol/L），1μl cDNA，2.5μl 10×PCR Buffer，0.2μl Taq酶，1.5μl Mg²⁺。

步骤（4）所述RT-PCR反应设定为94℃预变性5 min，94℃变性45s，52℃退火45s，72℃延伸1min循环33次，72℃延伸10min。所述扩增的产物通过2%琼脂糖凝胶电泳，得到665bp的CVB特异性片段和206bp的CChMVd特异性片段。