[发明专利]一种用于烟草花粉的高效诱变方法

说明书

技术领域

本发明涉及烟草诱变技术领域，特别是涉及一种用于烟草花粉的高效诱变方法。

背景技术

烟草(Nicotiana tabacum L，.)在植物分类学上属于双子叶植物纲(Dicotyledoneae)、管花目(Tubifiorae)、茄科(Solanaceae)烟草属(Nicotiana)，是许多国家的重要经济作物，其中烤烟(2n＝24II)是中国也是世界上种植面积最大的烟草类型。

长期以来，由于烟草育种中过度使用为数不多的几个主体亲本，加之定向选择，使得育成品种遗传基础狭窄、品种单一化现象日趋严重，导致很难培育出有较大突破性的新品种，经常出现新品种“审而不种”的尴尬局面，也给以遗传多样性为基础的分子标记遗传连锁图谱构建和基因定位带来了较大困难。

已有的研究表明，尽管不同烟草种间遗传多样性较种内稍显丰富，但相比其他农作物如水稻、油菜、玉米等其种质资源间的遗传多样性仍相差甚远。因为对种间杂交后代性状的改良其难度更大，所需时间更多，因此在实际的育种工作中较少会利用种间杂交方式培育新品种，而更多的是利用同一烟草类型即种内亲本来选育品种以缩短对目标后代综合性状的改良时间。因此，国内许多烟草科技工作者试图通过物理和化学等人为诱变的方法以有效拓宽烟草狭窄的遗传背景，丰富其种质资源的遗传多样性，这些诱变方法一般是利用X-射线、γ-射线、⁶⁰Coγ、中子、高速离子、宇宙射线等物理因素，或者甲基磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙酯(DES)、叠氮化钠、碱基类似物、PEG等化学因素对烟草种子、幼苗、茎尖、幼胚、合子等组织进行诱变处理，也取得了一些较好的成果。但这些诱变处理不同程度的存在诱变剂难吸收、诱变频率低、变异幅度小、后代筛选难度大、产量低及易产生嵌合体等问题。

发明内容

本发明根据现有技术的不足提供一种用于烟草花粉的高效诱变方法，该方法在烟草花粉离体液体培养的游离状态下施以EMS化学诱变，可大大增强烟草遗传物质对外界诱变因素的敏感性，从而成倍提高诱变频率和变异幅度，产生变异的花粉再经过加倍处理后以纯合二倍体的形式将突变性状予以很好的保持和固定，克服了基因表达上显隐性的障碍，有利于选择，且大大缩短了突变体性状稳定的周期，节省了育种时间

为实现上述目的，本发明所述的一种用于烟草花粉的高效诱变方法，其具体步骤依次如下：

(1)样品采集：取烟株主花序或侧花序上健康的、花粉处于单核靠边期的适龄花蕾，迅速保存于冰盒；

(2)消毒处理：在超净工作台上剥取花蕾中的花药，将取出的花药用无菌纱布或无菌市售丝袜装好浸入70-75％浓度的乙醇中消毒10-15s，再浸入饱和次氯酸钙溶液中浸泡8-10min，最后用无菌水漂洗多次；

(3)收集花粉：将步骤2中消毒处理后的花药放入圆底试管中，加入1-3ml的B5-13液体培养基，再加入1-2ml用于软化花药壁的酶液，碾成匀浆，然后用装有300-400目双层尼龙膜的漏斗进行过滤，并用离心管收集滤液，离心处理后去上清液，加B5-13液体培养基重新悬浮，再次离心处理后去上清液；

(4)诱变处理：将步骤3中经过两次离心处理后收集的花粉用B5-13液体培养基悬浮，加入浓度为0.1-0.2％的EMS(甲基磺酸乙酯)溶液进行诱变处理，放入温度为30-32℃的环境下避光培养8-10h；

(5)加倍处理：将步骤4中诱变处理后的花粉溶液移入离心管中离心处理后去上清液8-10min，再用NLN-16液体培养基悬浮后转入玻璃容器中，放置在温度为30-32℃的环境避光培养50-70h，进行加倍处理；

(6)诱胚培养：将步骤5中的加倍处理后的花粉溶液移入离心管中离心处理后去上清液，用NLN-13液体培养基悬浮花粉，转入培养皿中，放置在温度为24-26℃的环境下，进行避光诱胚培养14-21d，待培养皿中出现幼胚，便将培养皿放置转速为56-65r/min的摇床内，在温度为24-26℃环境下避光振荡培养6-8d；

(7)继代培养：将步骤6中培养皿内出现子叶的胚转移到MS固体培养基上，在温度为25-27℃、日光照为8-10h的环境中进行继代培养；

(8)幼苗转植：对步骤7中继代培养的幼苗进行炼苗，将通过炼苗后的幼苗根部的培养基清洗干净，移栽到温室的花钵中假植或者直接栽种于大田中进行突变体鉴定。

步骤1中所述的适龄花蕾为长度在2.0-2.3cm之间、花冠与花萼等长、花粉发育时期为单核靠边期的花蕾。