[发明专利]一种用于烟草花粉的高效诱变方法

权利要求书

1.一种用于烟草花粉的高效诱变方法，其特征在于：所述方法依次按以下操作步骤进行：

(1)样品采集：取烟株主花序或侧花序上健康的、花粉处于单核靠边期的适龄花蕾，迅速保存于冰盒；

(2)消毒处理：在超净工作台上剥取花蕾中的花药，将取出的花药用无菌纱布或无菌市售丝袜装好浸入70-75％浓度的乙醇中消毒10-15s，再浸入饱和次氯酸钙溶液中浸泡8-10min，最后用无菌水漂洗多次；

(3)收集花粉：将步骤2中消毒处理后的花药放入圆底试管中，加入1-3ml的B5-13液体培养基，再加入1-2ml用于软化花药壁的酶液，碾成匀浆，然后用装有300-400目双层尼龙膜的漏斗进行过滤，并用离心管收集滤液，离心处理后去上清液，加B5-13液体培养基重新悬浮，再次离心处理后去上清液；

(4)诱变处理：将步骤3中经过两次离心处理后收集的花粉用B5-13液体培养基悬浮，加入浓度为0.1-0.2％的EMS溶液进行诱变处理，放入温度为30-32℃的环境下避光培养8-10h；

(5)加倍处理：将步骤4中诱变处理后的花粉溶液移入离心管中离心处理后去上清液8-10min，再用NLN-16液体培养基悬浮后转入玻璃容器中，放置在温度为30-32℃的环境避光培养50-70h，进行加倍处理；

(6)诱胚培养：将步骤5中的加倍处理后的花粉溶液移入离心管中离心处理后去上清液，用NLN-13液体培养基悬浮花粉，转入培养皿中，放置在温度为24-26℃的环境下，进行避光诱胚培养14-21d，待培养皿中出现幼胚，便将培养皿放置转速为56-65r/min的摇床内，在温度为24-26℃环境下避光振荡培养6-8d；

(7)继代培养：将步骤6中培养皿内出现子叶的胚转移到MS固体培养基上，在温度为25-27℃、日光照为8-10h的环境中进行继代培养；

(8)幼苗转植：对步骤7中继代培养的幼苗进行炼苗，将通过炼苗后的幼苗根部的培养基清洗干净，移栽到温室的花钵中假植或者直接栽种于大田中进行突变体鉴定。

2.根据权利要求1所述的一种用于烟草花粉的高效诱变方法，其特征在于：步骤1中所述的适龄花蕾为长度在2.0-2.3cm之间、花冠与花萼等长、花粉发育时期为单核靠边期的花蕾。

3.根据权利要求1所述的一种用于烟草花粉的高效诱变方法，其特征在于：步骤2中的饱和次氯酸钙的浓度为10％；无菌水漂洗2-3次，每次4-6min。

4.根据权利要求1所述的一种用于烟草花粉的高效诱变方法，其特征在于：步骤3中所述酶液为纤维素酶、果胶酶、蜗牛酶和水的混合液，酶液中纤维素酶、果胶酶和蜗牛酶的质量浓度分别为0.6％、0.2％和0.5％。

5.根据权利要求1所述的一种用于烟草花粉的高效诱变方法，其特征在于：步骤3中第一次离心时间5min，转速1000r/min，二次离心时间5min，转速500r/min；步骤5和6中的离心处理时间都为5min，转速800r/min。

6.根据权利要求1所述的一种用于烟草花粉的高效诱变方法，其特征在于：步骤5中NLN-16液体培养基中秋水仙素的浓度为45-65mg/L。

7.根据权利要求1所述的一种用于烟草花粉的高效诱变方法，其特征在于：步骤5中加倍处理的玻璃容器为100ml三角瓶，每瓶装10ml溶液，密度为3-4蕾/ml。