[发明专利]硫堇蛋白类基因Rs-AFP1植物双元表达载体、构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及硫堇蛋白类基因Rs-AFP1植物表达载体、构建方法及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

硫堇蛋白(Thionins)是一类广泛存在于植物中的小分子(约5KD)生物活性肽，其家族成员较多，序列中富含半胱氨酸，可抑制消化酶的活性，并可通过与膜蛋白及脂质分子相互作用来抵抗及杀灭细菌及真菌等病原微生物的碱性蛋白。谷类单子叶植物及双子叶植物中均存在这类小分子肽，目前已从15种植物物种中分离出100多种硫堇蛋白。根据在植物中的进化关系，硫堇蛋白可分为α、β及γ类，其中α与β硫堇蛋白在空间结构上比较接近，而γ类硫堇蛋白因在构象与功能上与哺乳动物、昆虫防御素的空间构象及生物学功能相似，因此也可称其为植物防御素。Terras等研究发现，从十字花科植物中分离到的若干种植物防御素，如：Rs-AFP2、Dm-AFP1(大丽花属(Dahlia merckii)的抗病菌抵御素基因)等对几种植物致病真菌如B.cinema、A.brassicicola、F.culmorum的菌丝生长具有抑制作用，且已有研究表明，将外源编码硫堇蛋白的基因利用基因工程的方法转化入宿主植物中使之过表达，可改善并提高宿主植物的系统抗病能力。例如，在烟草中高水平表达一个从大麦中分离的硫堇蛋白类hordothionin基因提高了转基因烟草对丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的抗性；Iwai等在水稻中过表达一个从燕麦中分离到的细胞壁结合硫堇蛋白基因，显著提高了转基因水稻对多种细菌病害的抗性。1992年，Terras等从萝卜(Raphanus Sativus)种子中分离了一类6KD富含半胱氨酸的抗真菌蛋白，研究发现它主要由Rs-AFP1和Rs-AFP2两部分组成，二者含量几乎相等，它们主要通过引起菌丝过度分枝或抑制菌丝顶端生长，对植物的病原真菌发挥广谱抗性，且对细菌和人体培养细胞没有影响。表达模式研究显示，Rs-AFPs主要存在于萌发萝卜种子的子叶、胚轴和胚乳外层细胞的细胞壁中，且较其它类蛋白优先起作用，通过同化学杀真菌剂类似的作用机制，对作物种子及植物体所携带或感染的病原真菌进行抑制或杀灭。Terras还把Rs-AFP2划分为15个肽段进行研究，结果表明，肽段的第6、7、8、9组成了该基因的Cys27到Cys47区域，对许多真菌物种都表现出了抗真菌活性，并对阳离子有很强的敏感性。其中Tyr38对抗真菌活性影响起很大的作用。由于这种抗病相关特征结构域的存在，使硫堇蛋白基因Rs-AFPs在抗真菌性病害育种中，具有较好的应用性，在烟草、小麦、水稻、棉花等转基因抗病性育种方面均有报道。胡新文等(1996)在国内克隆到Rs-AFP1和Rs-AFP2基因，并将其插入pET-22b(+)，构建了表达载体，导入E.coli，用转化菌与对照菌裂解提取液对芭蕉炭疽菌(Colletotrichum musae)进行抑菌试验，发现前者具有强的抗真菌活性。1999年，中科院上海植生所的转萝卜抗真菌蛋白Rs-AFP1基因棉花在河南、北京已被批准进行中间试验。周向军等(2000)把切除了信号肽的Rs-AFP1基因与pET32b(+)融合表达，该蛋白对大丽轮枝菌(Verticillium dahlia kleb.)有抑菌作用。

水稻稻瘟病(Rice blast disease，RBD)是一种世界性的、毁灭性的真菌病害，又名稻热病，其病原菌为稻梨孢菌，通过侵染水稻引起稻瘟病，该病是危害我国水稻产区的最严重的三大水稻病害之一。20世纪90年代以来，我国稻瘟病年发生面积均在380万公顷以上，损失稻谷高达数亿公斤，每年因稻瘟病损失的稻谷大约可以满足6000万人口的粮食需求。由此可见，稻瘟病的流行严重威胁到水稻的高产和稳产。植物基因工程的兴起为病害的控制提供了更广泛的选择余地。利用该技术可向现有栽培品种中导入外源抗病基因而不受种属限制，拓展了可利用基因的来源，这无疑为作物抗病育种工作开辟了一条崭新而有效的途径。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种硫堇蛋白类基因Rs-AFP1植物双元表达载体、构建方法及农杆菌介导获得转基因抗稻瘟病水稻菌株的方法。

本发明的硫堇蛋白类基因Rs-AFP1，它具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。

编码具有抗真菌能力的硫堇蛋白类抗菌肽，Rs-AFP1基因编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。