[发明专利]硫堇蛋白类基因Rs-AFP1植物双元表达载体、构建方法及应用

权利要求书

1.硫堇蛋白类基因Rs-AFP1植物双元表达载体，其特征是，它为pCA1300-Ubi-Rs-AFP1，它是在植物双元表达载体pCA1300-Ubi的PstI和SacI酶切位点之间插入由基因Rs-AFP1和pMD18T载体构建的重组质粒pMD18T-Rs-AFP1。

2.权利要求1所述的硫堇蛋白类基因Rs-AFP1植物双元表达载体的构建方法，其特征是，

(1)以水发的小萝卜幼苗为材料，Trizol法提取其总RNA，反转录后获得第一链cDNA；以反转录后获得的第一链cDNA为模板，根据特异性引物进行PCR扩增，克隆得到了大小为243bp的Rs-AFP1基因；1％的琼脂糖凝胶检测PCR产物；

所述特异性引物为：

RsAFP 1-1：5’-ATGGCTAAGTTTGCGTCC-3’

RsAFP 1-2：5’-TTAACAAGGAAAGTAGCAGATAC-3’

(2)回收PCR产物；将回收的片段用T4连接酶连接至pMD18T载体中，构建成克隆载体；然后将其转化大肠杆菌感受态细胞DH5α；阳性克隆进行PCR检测后经质粒提取和质粒酶切检测，获得重组质粒pMD18T-Rs-AFP1；

(3)用Pst I和Sac I双酶切重组质粒pMD18T-Rs-AFP1，同时用这两个酶双酶切以玉米泛素Ubi为启动子、以bar基因为选择标记的植物双元表达载体pCA1300-Ubi；酶切产物分别进行电泳后会后，T4连接酶连接，构建成植物表达载体pCA1300-Ubi-Rs-AFP1；然后将其转化大肠杆菌感受态细胞DH5α；阳性克隆进行PCR检测后经质粒提取和质粒酶切检测得到植物表达载体pCA1300-Ubi-Rs-AFP1。

3.权利要求1所述的硫堇蛋白类基因Rs-AFP1植物双元表达载体在制备转基因抗稻瘟病水稻菌株方面的应用。

4.农杆菌介导获得转基因抗稻瘟病水稻菌株的方法，其特征是，

(1)种植水稻诱导与继代培养

取水稻种子消毒后平铺在无菌滤纸上，晾干后置成熟胚于诱导培养基中，在28℃光照培养箱，培养4周；4周后用镊子挑取自然分裂的健康的胚性愈伤组织，置入继代培养基中，在28℃光照培养箱中继代培养1-2周；继代2-3次，获得成熟的愈伤组织；

(2)预培养

选取相对紧凑干燥的愈伤颗粒进行预培养，28℃暗培养4天，备用；

(3)农杆菌培养

愈伤组织预培养2天后，将已转化植物表达载体pCA1300-Ubi-Rs-AFP1的农杆菌菌液接于YEP培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD₆₀₀为0.8-1.0，备用；

(4)侵染及共培养

取培养好的菌液制成悬浮液；将长到一定大小的预培养的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液中侵染30min；然后取出沥干后将愈伤组织转移至共培养基上，19-20℃暗培养3d；

(5)愈伤组织的抗性筛选

将愈伤组织取出，经清洗、沥干后，将晾干的愈伤组织进行3次抗性筛选；

(6)抗性愈伤组织的诱导分化和生根

进行三次抗性筛选之后，挑取颜色鲜黄的抗性愈伤移入预分化培养基中，28℃暗培养5-7天，再转移至分化培养基中，放入多功能气候箱中，等待分化成苗；待苗长至1cm，放入生根培养基中壮苗；

(7)转基因苗的锻炼和移栽

将苗根部和茎叶分化得较完好的培养皿挑出，加入无菌水，炼苗3-4天，然后洗净根部培养基，移至栽培缸，于温室中培养。