[发明专利]基于高分辨率溶解曲线的黄瓜杂交种纯度鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于农业的蔬菜育种与应用技术领域，具体涉及黄瓜杂交种纯度鉴定方法，是一种基于高分辨率溶解曲线分析技术（high resolution melting，HRM）的杂交种种子纯度鉴定方法。

背景技术

纯度是种子重要的指标，关系农业生产产量和农民收入，用于蔬菜种子纯度及品种鉴定的方法有田间试验、RAPD、SSR等技术，但在操作性、稳定性、多态性等方面不能满足目前的需要。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，主要有密度高，遗传稳定性好、具有代表性、分析易自动化等特性，已成为继微卫星之后的新一代遗传学标记，近年来被广泛应用于蔬菜分子辅助育种及品种鉴定。Jin-kee Jung等（2010）利用Allele Speci?c PCR (AS-PCR)从conserved ortholog set II (COSII) markers中筛选出40个辣椒SNP位点，能区分81个商品种子中的79个，能鉴定17个甜辣椒；Wim Deleu等（2009）从甜瓜公共EST数据库发掘SNP标记，鉴定获得45个SNP位点，丰富了甜瓜基因变异图谱，并将SNP标记用于甜瓜品种鉴定。

是由犹他大学和爱德华科技公司合作开发的一种SNP及碱基突变研究的技术（Gundry C N，2002），是常规溶解曲线技术与饱和荧光染料和高精密度PCR仪相结合的再发展技术。其原理是通过实时监测精密升温过程中双链DNA饱和荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，以区分出PCR产物中碱基的细微差异。HRM技术具有高通量、低成本、操作简便、闭管检测、分析简单等优势，广泛应用于医学分子分型诊断及甲基化研究。

用于植物DNA变异检测的历史较短，但已涉及多个研究方向。David De Koeyer等（2009）评估了HRM技术在马铃薯分型和多倍体检测上的应用，认为HRM技术在马铃薯基础和应用研究上非常有用；Hee-Jin Jeong等（2011）利用HRM技术对区分6类辣椒品种及进行品种鉴定；Shu-Biao Wu等（2009）通过HRM技术对杏树中12个SNP-anchored putative基因进行分型分析，并完善遗传图谱，为后续的功能研究奠定基础。

本专利将HRM技术应用于黄瓜SNP位点筛选，并获得2个SNP位点，平均每481 bp 筛选出1个SNP，验证了HRM技术在黄瓜SNP筛选工作中的可行性。本研究通过Illumina Eco real-time PCR system进行HRM研究，在试验过程中，充分体现了HRM技术快速、低成本、操作方便和闭管检测防止污染等优势。筛选出的2个SNP位点在市售黄瓜品种中具有较强的多态性，适宜于其中11个品种的纯度鉴定，并且具备用于品种鉴定的潜能，为完善黄瓜遗传图谱及相关功能基因研究打下基础。

发明内容

本发明的目的在于公开了一种基于高分辨率溶解曲线分析技术（high resolution melting，HRM）的杂交种种子纯度鉴定方法，为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

本方法通过对供试黄瓜杂交种进行DNA提取、PCR扩增和HRM分析，确认CLA1或CLA6 SNP位点分型，从而对黄瓜杂交种进行纯度鉴定。候选SNP位点类型及PCR引物见下表：

供试黄瓜杂交种取样及DNA提取方法为：每品种取40粒种子，去壳，液氮冷冻研磨（Retsch MM400生物粉碎仪），加入CTAB裂解缓冲液（20 g/L CTAB，1.4 M NaCl，0.1 M Tris-HCl，20 mM Na2EDTA）500μL，65℃恒温水浴（Neslab）裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒（赛百盛）操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50±1 ng/μL，Nanodrop ND1000，Thermol）。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。

供试黄瓜杂交种PCR方法为：

(1)CLA1上游引物序列H-A1F1：5’-GAAACAAAAAAACACATTACTCCCA -3’， CLA1下游引物序列H-A1R1： 5’- CTGCACAATCGTCAACACT -3’。