[发明专利]基于高分辨率溶解曲线的黄瓜杂交种纯度鉴定方法

权利要求书

1.用于SNP位点CLA1 HRM分析的一对PCR扩增引物，其特征在于，包括上游引物序列：5’- GAAACAAAAAAACACATTACTCCCA -3’， 下游引物序列： 5’- CTGCACAATCGTCAACACT -3’。

2.用于SNP位点CL-A6 HRM分析的一对PCR扩增引物，其特征在于，包括上游引物序列：5’- GTGGGTGAGTTTTATCTTTAAACGA -3’， 下游引物序列： 5’- CTTCAATTCTACTGGCTCCAT -3’。

3.一种采用权利要求1或2所述引物，基于高分辨率溶解曲线分析技术的黄瓜杂交种种子纯度鉴定的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）采用权利要求1或2所述的 PCR扩增引物对供试种子样品模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应的总体积为10 μL，扩增反应体系为：2×带有ROX的Platinum 定量PCR SuperMix-UDG（invitrogen）5 μL，20×Evagreen（biotium）0.5μL，上游和下游引物10μmol/L，各0.2μL，供试黄瓜杂交种基因组DNA模板（50 ng/μL）0.5μL，双蒸水补足10 μL；PCR反应程序为95℃预变性10 min，40个扩增循环（95℃ 15 sec，60℃ 30 sec）；

（2）对PCR扩增产物进行HRM分析，程序为95℃ 变性15 sec，55 ℃退火15 sec，然后逐步上升至95℃保持15 sec；

（3）通过分析HRM结果，比较标准样品和供试种子样品的标准视图和差异视图，对供试种子样品进行SNP分型；通过计算供试种子样品中杂交种数量占总种子数量的比例确定种子纯度。