[发明专利]植物茎尖转化方法及其专用工具

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种植物茎尖转化方法及其专用工具。

背景技术

植物遗传转化方法就是通过特定的方式将外源基因导入到受体细胞内，使之发生定向的、永久的遗传变异。目前，人们已经建立了多种转化系统。对大多数遗传转化系统而言，遗传转化方法是遗传转化系统的关键环节，决定着转化的成败及效率。用于植物的转化方法有许多：农杆菌介导法，基因枪法，电击法、PEG法等。农杆菌介导法和基因枪法已成为目前用于遗传转化的主要方法。

过去认为受农杆菌宿主范围限制，农杆菌介导的遗传转化仅限于双子叶植物。最早报道的采用农杆菌介导法转化成功的植物单子叶植物是石刁柏，之后相继在水稻、玉米、大麦、甘蔗等重要作物中获得了农杆菌介导的转基因植株，并有充足的分子和遗传证据。虽然大多数单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，但随着对农杆菌转化植物细胞原理的深入认识，通过添加外源信号物质如乙酰丁香酮(AS)等也可以实现农杆菌对单子叶植物的转化。由于农杆菌转化利用天然的整合系统实现DNA的转移，该法具有转基因拷贝数低、遗传稳定、成本低廉等优点使农杆菌成为大多数遗传转化的首选方法。

植物受体的选择是遗传转化系统的另一重要因素。目前农杆菌转化的植物受体主要包括幼胚及其胚性愈伤组织、叶盘、子叶、子叶节、下胚轴等外植体。这些受体都需要经过脱分化过程形成愈伤组织，然后经过再分化再生植株。组织培养和遗传转化能否成功在很大程度上取决于受体基因型，绝大多数具有重要经济价值的基因型难以利用，植株再生频率很低，并且组织培养过程中易发生体细胞无性系变异。因此，选择合适的外植体作为农杆菌转化的受体，建立不受基因型限制的遗传转化体系仍是目前研究的重点之一。

近年来，利用离体茎尖分生组织直接再生系统进行的转基因研究工作逐渐增多，并取得重要进展。1988年，McCabe等用基因枪转化大豆离体茎尖获得了转基因植株。1991年Gould等用玉米离体茎尖与农杆菌共培养获得了转化植株及子代。Zapata等(1999)和Satyavathi等(2002)分别用农杆菌介导法转化棉花离体茎尖都获得了转基因植株。离体茎尖分生组织不需要脱分化过程，茎尖转化后直接再生植株，这使转化周期大大缩短，并一定程度上打破了基因型限制，因此显示出良好的应用前景。

农杆菌介导的小麦遗传转化是一道难题。据统计，在2002年前获得小麦转基因植株的报道中，基因枪法占90％左右，其他方法仅占10％。1997年，Cheng等利用农杆菌介导法转化小麦成功，标志着小麦遗传转化的另一个里程碑。由于小麦离体培养受基因型的影响大、多数品种植株再生频率低、对农杆菌感染不敏感、组织培养过程中易发生体细胞无性系变异等原因，使得通过农杆菌介导的遗传转化进展慢，批量获得转基因小麦植株仍受基因型限制很大，以致小麦基因工程研究远落后于其它主要农作物。另外，小麦的基因组有1.7×10¹⁰bp，是水稻基因组的40倍，是玉米基因组的6倍，是拟南芥基因组的100倍，巨大的基因组导致转基因植株的分子鉴定难度大，特别是Southern杂交分析，影响了转基因小麦的后代研究。影响小麦遗传转化的因素如小麦基因型、外植体类型、浸染及共培养时间、农杆菌菌株与筛选剂等近年来都得到了广泛研究，但转化效率明显低于其它主要农作物的。

盐角草(Salicornia europaea)是属于藜科的一种肉质化真盐生植物，广泛分布在沿海和内陆盐湖附近，能够积累高到干重50％的NaCl，被认为是世界上最耐盐的一种高等植物。盐角草具有发展为蔬菜、油料作物及饲料作物的潜力。建立高效稳定的盐角草遗传转化体系对于挖掘研究其抗逆基因功能及其自身的形状改良具有重要意义。Shi等(2006)以成熟胚为外植体诱导愈伤组织并实现了植株再生，建立了盐角草的体外再生体系。然而该体系的愈伤诱导率和植株再生率很低，很难用于批量遗传转化。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明提供的培育转基因植物的方法，包括如下步骤：

1)刺伤目的植物的茎尖生长点，得到处理后目的植物；

2)用含有目的DNA的重组农杆菌菌液侵染步骤1)得到的所述处理后目的植物，得到浸染后幼苗；

3)培养步骤2)得到的浸染后幼苗，得到含有所述目的DNA的转基因植物。

步骤1)中，所述刺伤采用下述的金属刷；

步骤2)中，所述含有目的DNA的重组农杆菌菌液按照如下方法制备：

A)将所述目的DNA通过重组载体导入根癌农杆菌得到重组农杆菌；