[发明专利]一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗烟草青枯病的菌剂，具体地说是一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，属于生物菌剂领域。

背景技术

烟草青枯病是一种细菌病害，在各烟区普遍发生，常常暴发流行，造成毁灭性损失。该病病源：青枯雷尔氏菌和青枯假单胞杆菌，能侵染30余科的200多种植物。对烟草、番茄、花生及马铃薯侵害更明显。常与黑胫病等根茎病害混合发生，危害更严重。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）广泛存在于自然界中，该菌作为植物病害生物防治细菌之一，由于该菌能产生耐热的芽孢，即易于生产、菌剂的加工，又易于存活、定植和繁殖。批量生产工艺简单，成本也较低，施用方便，储存期长，而且其菌剂的稳定性与化学农药的相容性、以及与不同植物不同年份防治效果的一致性方面均优于不产生芽孢的细菌和真菌，是一种较理想的生防微生物。

发明内容

本发明的目的在于，提供了一种对烟草青枯病害具有高效、无毒、安全以及对环境无污染的微生物枯草芽孢菌剂的制备方法。

在芽孢杆菌发酵后期，通过合理调节发酵生产参数的控制、添加调配功能性的有机氮源，促使芽孢杆菌在后期代谢性生长，产生碱性蛋白的代谢，再通过调整发酵工艺控制参数，促使菌体形成芽孢，当菌体芽孢形成率达到55～65%以上时，不再做发酵液pH的调整，让其自然变化，当发酵液菌体形成芽孢率在85%以上，最终发酵液pH值自然提高至7.7～8.0时，发酵结束。

本发明的技术方案：

一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：

1、菌种活化：对保藏的枯草芽孢杆菌进行活化培养至芽孢脱落；

活化所用的培养基配方为：牛肉胨3g，蛋白胨5g，琼脂16g，水定容至1000ml；用于枯草芽孢杆菌的活化及活菌数的测定；

2、摇床扩大培养：将活化后的枯草芽孢杆菌接种到液体培养基中进行摇床扩大培养。初始pH值为7.0～7.2，培养温度为30℃，摇床转速为200rpm，至15～20％的芽孢脱落为止；

所用的液体培养基的配方为：玉米粉6.5g，葡萄糖 2.5g，豆饼粉10.1g，鱼粉2.5g，CaCO₃ 3.5g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，K₂HPO₄ 0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，MnSO₄·H₂O 0.1g，水定容至500ml。

3、种子罐扩大培养：在无菌操作下，将摇床扩大培养得到的菌液接入到含有种子罐培养基的种子罐内，初期通风比1︰0．25，即一立方发酵液一分钟通气量为0.25立方，后期通风比1︰1；同时，控制发酵液的pH值为6.9～7.3，温度为32℃，发酵罐的搅拌转速为80～220 rpm；至芽孢杆菌进入对数生长期的后期；

及时进行对种子发酵液的检查和对芽孢杆菌生长状况的观测；菌种接种后12h菌体生长处于指数生长中期；当芽孢杆菌进入对数生长期的后期，进行无菌转种接入发酵罐，进行发酵；

所用的种子罐培养基配方为：玉米粉12.98g，葡萄糖5g，豆饼粉20.1g，鱼粉5g，CaCO₃ 6.90g，(NH₄)₂SO₄ 1g，K₂HPO₄ 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O 0.2g，水定容至1000ml。

4、发酵罐发酵

将培养至指数生长期后期的种子罐菌液在无菌条件下转入装有发酵罐培养基的发酵罐，罐装量为发酵罐容积的70％，进行发酵罐的前期培养和后期培养；

（1）发酵罐前期培养方法为：对接入种子液的发酵罐，温度28～32℃，pH6.9～7.3，通风量1︰0．25～1.1，搅拌转速150～180 rpm；保持发酵液总糖含量0.35～0.6%、总氮含量30～45ng/ml，培养至芽孢形成率55～65%，进入发酵后期；

发酵罐前期培养期间要及时检查和观测菌种生长状况，随着菌种的增长，菌体密度的增加，逐渐加大通风量，增加溶氧，提高转速，以配合菌种生长的需氧量，同时，通过与发酵罐相连的无菌补液罐来维持发酵液pH值；