[发明专利]一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法

权利要求书

1.一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于：由以下方法制备而成：

（1）菌种活化：对保藏的枯草芽孢杆菌进行活化培养至芽孢脱落；

（2）摇床扩大培养：将活化后的枯草芽孢杆菌接种到液体培养基中进行摇床扩大培养，初始pH值为7.0～7.2，培养温度为30℃，摇床转速为200rpm，至15～20％的芽孢脱落为止；

（3）种子罐扩大培养：在无菌操作下，将摇床扩大培养得到的菌液接入到含有种子罐培养基的种子罐内，初期通风比1︰0.25，后期通风比1︰1；同时，控制发酵液的pH值为6.9～7.3，温度为32℃，发酵罐的搅拌转速为80～220 rpm；至芽孢杆菌进入对数生长期的后期；

（4）发酵罐发酵：将培养至指数生长期后期的种子罐菌液在无菌条件下转入装有发酵罐培养基的发酵罐，罐装量为发酵罐容积的70％，进行发酵罐的前期培养和后期培养；

（5）菌剂的制备：发酵罐发酵结束后，降低发酵通风比至1︰0.08，维持发酵罐压力0.02MPa，降低搅拌转速至20rpm，对发酵液降温至10℃以下；然后通过膜过滤浓缩处理，将发酵液体积浓缩至原来的1/5～1/8；再添加调配缓冲保护剂，混合均匀后，对浓缩后的发酵液进行喷雾干燥处理，得到菌剂产品。

2.根据权利要求1所述的一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤（1）活化所用的培养基配方为：牛肉胨3g，蛋白胨5g，琼脂16g，水定容至1000ml。

3.根据权利要求1所述的一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤（2）的液体培养基的配方为：玉米粉6.5g，葡萄糖 2.5g，豆饼粉10.1g，鱼粉2.5g，CaCO₃ 3.5g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，K₂HPO₄ 0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，MnSO₄·H₂O 0.1g，水定容至500ml。

4.根据权利要求1所述的一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤（3）的种子罐培养基配方为：玉米粉12.98g，葡萄糖5g，豆饼粉20.1g，鱼粉5g，CaCO₃ 6.90g，(NH₄)₂SO₄ 1g，K₂HPO₄ 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O 0.2g，水定容至1000ml。

5.根据权利要求1所述的一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤（4）的发酵罐培养基的配方为：玉米粉12.98g，葡萄糖5g，豆饼粉20.1g，鱼粉5g，CaCO₃ 6.90g，(NH₄)₂SO₄ 1g，K₂HPO₄ 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O 0.2g，水定容至1000ml。

6.根据权利要求1所述的一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤（4）的发酵罐前期培养方法为：对接入种子液的发酵罐，温度28～32℃，pH6.9～7.3，通风量1︰0．25～1.1，搅拌转速150～180 rpm；保持发酵液总糖含量0.35～0.6%、总氮含量30～45ng/ml，培养至芽孢形成率55～65%，进入发酵后期。

7.根据权利要求1所述的一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤（4）的发酵罐后期培养方法为：使用有机氮源调节发酵液的总氮含量，控制总氮含量在40ng/ml以上，培养至芽孢形成率80%以上、pH值7.7以上，后期发酵结束。