[发明专利]一种提高牛腔前卵泡体外发育的培养基及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及畜牧学(动物繁殖)，尤其涉及一种提高牛腔前卵泡体外发育的培养基及其应用。

背景技术

牛卵巢上有数万个原始卵泡，在其生长成熟过程中，有相当数量的卵泡退化、闭锁，仅有极少数的卵泡发育到成熟阶段，直至排卵。在雌性生殖资源中，卵母细胞是体外受精、胚胎移植、性别控制、胚胎分割、动物克隆和转基因等胚胎生物技术研究和开发必不可少的材料，卵母细胞来源匮乏成为制约这些技术研究进展的主要因素，因此卵巢腔前卵泡的开发无疑是解决这一难题的有效途径。

与普通的体细胞培养和来自有腔阶段的卵泡卵母细胞的体外成熟培养比较，哺乳动物腔前卵泡的体外培养难度更大。尽管如此，1989年Eppig等用两步法体外培养小鼠腔前卵泡，获得成熟卵母细胞并成功产下正常后代，自此人们先后在其它动物上开始了腔前卵泡体外培养的研究。特别是在牛、羊、猪等家畜方面研究较多，并且在研究内容、手段和方法上都取得了一些进展。但是到目前为止，仍未建立起一套牛腔前卵泡体外培养的体系。因此，进一步优化和建立牛腔前卵泡体外培养体系显得尤为重要。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种制备促进离体哺乳动物腔前卵泡体外发育的培养基的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、丙酮酸钠、谷氨酰胺、次黄嘌呤、血清、促卵泡素、促黄体素、雌激素、PTEN抑制剂、水和α-MEM培养基混合，得到培养基，所述胰岛素在所述培养基中的浓度为5ug/ml，所述转铁蛋白在所述培养基中的浓度为5ug/ml，所述亚硒酸钠在所述培养基中的浓度为5ng/ml；所述丙酮酸钠在所述培养基中的浓度为(0.21-0.29)mmol/l，所述谷氨酰胺在所述培养基中的浓度为(1.5-2.0)mmol/l，所述次黄嘌呤在所述培养基中的浓度为(1.8-2.5)mmol/l，所述血清在所述培养基中的浓度为5％-10％(体积百分含量)，所述促卵泡素在所述培养基中的浓度为0.25μg·ml^-1-0.5μg·ml^-1，所述促黄体素在所述培养基中的浓度为5IU ml^-1-10IU ml^-1，所述雌激素在所述培养基中的浓度为0.5μg·ml^-1-1.0μg·ml^-1，所述PTEN抑制剂在所述培养基中的浓度为100nmol/L-10μmol/L，所述α-MEM培养基在所述培养基中的浓度为10.1g/L。

所述丙酮酸钠在所述培养基中的浓度为0.21mmol/l、0.23mmol/l或0.29mmol/l；所述谷氨酰胺在所述培养基中的浓度为1.5mmol/l、1.8mmol/l或2.0mmol/l，所述次黄嘌呤在所述培养基中的浓度为1.8mmol/l、2mmol/l或2.5mmol/l，所述血清在所述培养基中的浓度为5％、7.5％或10％(体积百分含量)，所述促卵泡素在所述培养基中的浓度为0.25μg·ml^-1、0.4μg·ml^-1或0.5μg·ml^-1，所述促黄体素在所述培养基中的浓度为5IU ml^-1、8IU ml^-1或10IU ml^-1，所述雌激素在所述培养基中的浓度为0.5μg·ml^-1、0.8μg·ml^-1或1.0μg·ml^-1，所述PTEN抑制剂在所述培养基中的浓度为100nmol/L、1μmol/L或10μmol/L。

所述血清为胎牛血清；

所述雌激素为雌激素E2；

所述PTEN抑制剂为PTEN抑制剂pic。

所述哺乳动物为牛。

所述的方法制备的培养基也是本发明保护的范围。

所述的培养基在促进离体哺乳动物腔前卵泡体外发育中的应用。

所述哺乳动物为牛。

所述离体哺乳动物腔前卵泡体外发育通过增加卵泡直径和/或提高卵泡成腔率体现。