[发明专利]一种肥厚型心肌病基因分型方法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及基因分型领域，具体属于一种肥厚型心肌病基因分型方法及其检测试剂盒。

背景技术

肥厚型心肌病(HCM)是最常见的心肌病之一，以左心室和右心室及室间隔非对称性肥厚为特征，排除其他可能引起心肌肥厚的心血管疾病和全身疾病。其临床表现多样，从无症状到轻度胸闷、心悸再到恶性心律失常、心力衰竭，甚至青少年时期猝死等。

据估计，在普通人群中HCM发病率约为1/500。随着分子生物学的迅猛发展和人类基因组计划的完成，心肌病的致病基因研究取得了很大进展。已证实肥厚型心肌病为常染色体显性遗传疾病，单一等位基因突变即可致病。该病约有55％发病呈家族聚集性，称为家族性肥厚型心肌病(FHCM)。迄今为止，已确定了11个编码肌节蛋白基因的200余种突变，可引起单纯性HCM，不伴有其他心脏表现和心脏外表现。其中包括5个编码粗肌丝的基因：β-肌球蛋白重链基因(MYH7)，肌球蛋白结合蛋白C基因(MYBPC3)。α-肌球蛋白重链基因(MYH6)，必需轻链基因(MYL3)，调控轻链基因(MYL3)；5个编码细肌丝的基因：心肌肌钙蛋白T基因(TNNI3)，肌动蛋白基因(ACTC)，肌钙蛋白T基因(TNNI2)，心肌肌钙蛋白C基因(TNNC1)和α-原肌球蛋白基因(TPM1)；1个编码粗丝联接蛋自基因：TTN。其中，最常见的三种突变类型是β-肌球蛋白重链基因(MYH7)、肌球蛋白结合蛋白C基因(MYBPC3)和心脏肌钙蛋白T基因(TNNT2)，占家族性肥厚型心肌病的70-90％。

肥厚型心肌病由于临床表现十分多样，目前确诊主要是靠实验室检查。超声心电图目前仍是肥厚型心肌病诊断最常用、最可靠、最经济的诊断方法。另外还有心脏核磁、心电图改变等检查方法。但是临床诊断方法不足之处是被确诊的患者都是已经发展到了发病的中晚期，这对治疗和手术来说都是不利因素。

HCM的致病基因及突变位点在不同国家、不同种族之间的分布差异很大。而HCM心肌病已成为影响我国居民身心健康及人口生存质量的重大公共卫生问题，鉴于越来越多的心肌病与遗传因素有关，对于心肌病的基因分型已经越来越有必要，而国内外在这方面目前还是空白。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是通过对HCM的致病基因MYH7、MYBPC3和TNNT2进行基因突变的检测，从基因序列和分子结构水平来辅助鉴定是否携带HCM心肌病致病基因突变。

本发明提供的技术方案为提供一种肥厚型心肌病基因分型方法，所述方法包括：

a、对样本DNA中基因MYH7、MYBPC 3和TNNT2进行基因突变的检测，所述基因突变的检测包括MYH7、MYBPC3和TNNT2的基因外显子的PCR扩增及DNA测序，

c、将步骤b中扩增测序后得到的序列与数据库中的标准序列进行比对，从而确定基因分型结果。

优选的，所述PCR扩增及DNA测序包括PCR序列扩增、PCR产物纯化和双脱氧链终止法DNA测序。

优选的，所述PCR序列扩增的反应体系为1μL的10×PCR Buffer、1μL的2μM引物、1μL的2mM dNTP mix、1μL15mM的MgCl₂、1U的Taq酶、1μL 20ng/μL的DNA模板，然后加双蒸水至10μL，

反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共35个循环；72℃延伸5分钟。

优选的，所述双脱氧链终止法DNA测序的反应体系为0.25uL的2.5×BigDye、0.875uL5×BigDye Seq Buffer、1uL5pmoL/μL的引物、1.875uL灭菌去离子水、1uL纯化的PCR产物；

反应条件：94℃预变性2分钟；94℃变性10秒，55℃退火10秒，60℃延伸3分钟，25个循环。

优选的，所述PCR产物纯化采用EDTA-乙醇法。

优选的，所述双脱氧链终止法DNA测序所用的通用测序引物序列如SEQ ID NO：1-2所示。

优选的，所述MYH7基因外显子的PCR扩增引物碱基序列如：SEQ ID NO：3-28所示；

所述MYBPC3基因外显子的PCR扩增引物碱基序列如：SEQ ID NO：29-50所示；