[发明专利]一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物医药体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种快速检测结核分枝杆菌异烟肼耐药基因(katG 315位与inhA -15位)突变的方法及试剂盒。

背景技术

近年来，耐药结核病问题日趋严重，已成为结核病控制的难题之一。由于抗结核药物的不规范治疗, 患者体内的结核杆菌对多种抗结核药物发生耐药, 从而形成耐多药结核病, 这是结核病疫情重新上升的最主要原因之一。因此，结核病的快速诊断和最佳个体化治疗方案的建立是结核控制中的重要挑战之一。

由于结核分枝杆菌生长缓慢，如今广泛应用的耐药测定方法均是建立在菌株的基础上，虽然使用了新的液体培养基，但仍然耗时较长，推迟了获得菌株敏感型的时间。在现阶段，我国各医院广泛采用痰培养加药物敏感性实验来检测结核杆菌的耐药性，即先培养出结核杆菌，再给予抗结核药物，并观察药物抑菌效果。该法的检测结果可靠，但最大不足之处是培养条件要求高，结核杆菌生长缓慢，往往需要6-8周；同时痰培养检出率低，仅为30%，故药敏试验的检出率也仅有30%左右，不能满足临床检测需要。因此，开发一种快速准确诊断耐多要结核病的检测方法，对于早期发现、阻断耐药结核病的传播，规范指导用药，提高耐药结核病的治愈率具有非常重要的意义。近年来报道了许多检测结核耐药突变的分子生物学方法，然而这些方法往往需要大量的人力和长势良好的培养基。临床诊断需要一种简单、快速、重复性好的方法对一系列与结核耐药相关的基因突变进行检测。Real-time PCR技术结合了PCR的灵敏性和DNA杂交的特异性等优点，具有操作简单，结果判断直观以及无污染等特点，在临床诊断中已被广泛用于多种微生物病原体DNA的检测。因此，本发明将Real-time PCR(Taqman/MGB水解探针)技术成功引入到结核分枝杆菌耐药基因检测的领域中。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术发明至今已20年，在此期间得到了不断发展，近年来出现的实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR)技术实现了PCR从定性到定量的飞跃。它以特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中重要工具。目前real-time PCR所使用的荧光化学方法主要有5大类，分别是：DNA结合染料，水解探针（Taqman和MGB探针），分子信标（molecular beacon）,荧光标记引物，杂交探针。他们又可分为扩增序列特异和非特异检测两类。扩增序列非特异性检测方法的基础是DNA结合的荧光分子，如SYBR Green I等荧光染料。SYBR Green I荧光染料特异性地掺入DNA双链后，可发射荧光信号。荧光染料的优势在于能检测任何dsDNA序列的扩增，不需要探针的设计，使检测方法变得简便，同时也降低了检测的成本。但正是由于荧光染料能和任何dsDNA结合，因此它也能与非特异的dsDNA(例如引物二聚体)结合，使实验容易产生假阳性信号。扩增序列特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光基团的基因特异性寡核苷酸探针来检测扩增产物。它又可分为直接法和间接法。间接法就是利用水解探针的策略。目前在real-time PCR中最广泛使用的Taqman系统就是运用这个原理。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性荧光探针。该探针是一段寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，检测不到该探针5’端荧光基团发出的荧光。但在PCR扩增中，溶液中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结核。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合出，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针5’荧光基团从探针上切割下来，游离于体系中，从而脱离3’端荧光淬灭基团的屏蔽而发出荧光信号，而且是每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子成功发光，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成的完全同步。为取得较高的分辨率和优秀的信噪比，还可以选用Taqman MGB 探针。MGB探针其显著优点是长度短，信噪比好，为非荧光淬灭基团，性能稳定而荧光干扰小；分辨率高，可以区分一个碱基。一个碱基不同即可引起Tm值的大幅降低如20度，错配既可为阴性结果，广泛应用于SNP分析。而常规的Taqman探针具有一定容错能力，1-3个碱基错配有可能不影响检测，Tm值相差不大，结果仍为阳性。