[发明专利]一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变的检测方法，其特征在于具体步骤包括：

通过扩增反应，扩增结核分子杆菌基因组序列，其中，所述基因组的区域中的突变引起了结核分枝杆菌的异烟肼耐药；

所述扩增反应的扩增体系包括2条标记的寡核苷酸探针，2对扩增引物和一个热稳定的DNA聚合酶；

所述标记的寡核苷酸探针与扩增的基因组序列杂交，产生可判读的扩增曲线图；

所述标记的寡核苷酸探针与靶核苷酸序列杂交区至少包含一个异烟肼基因突变位点，而且所述标记的寡核苷酸探针与野生型靶核苷酸互补；

所述寡核苷酸探针是双标记探针，包括一个报告标记荧光基团和一个淬灭标记基团。

2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变的检测方法，其特征在于所述基因组区域选自与耐异烟肼相关的katG基因、inhA基因启动子区；

所述基因组区域中的突变包括：katG基因的315位点，inhA基因的-15位点。

3.根据权利要求1或2所述的结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变的检测方法，其特征在于所述2条寡核苷酸探针为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，所述2对扩增引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求1或2或3所述的结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变的检测方法，其特征在于所述DNA聚合酶是具有5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶。

5.根据权利要求1—4之一所述的结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变的检测方法，其特征在于所述报告标记是荧光基团，它标记在寡核苷酸探针5’末端，种类是FAM、TET、JOE、HEX、CY3、ROX、CY5中任一种；所述淬灭标记是荧光或者非荧光基团，它标记在探针3’末端，种类是TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB中任一种。

6.一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变的探针，其特征在于此探针由13~19个核苷酸组成，为SEQ ID NO.5 和SEQ ID NO.6所示；上述探针包括一个标记在5’端的报告标记荧光基团和一个标记在3’端的淬灭标记基团；在PCR反应退火阶段，此探针与结核分子杆菌的katG 315位区域以及inhA启动子-15位区域杂交，然后在带5’->3’外切酶活性的DNA聚合酶催化引物延伸过程中，被DNA聚合酶切离，令报告标记游离出来，发出荧光。

7.一个从样本中检测结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变的试剂盒，其特征在于包括：至少两对扩增引物和至少两条标记的寡核苷酸探针，一种热稳定并且具有5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶，以及PCR扩增所需要的其他常用组分；其中所述两对扩增引物为SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述两条探针为SEQ ID NO.5 和SEQ ID NO.6所示。