[发明专利]一种体外酶反应生成的类胡萝卜素的快速提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种体外酶反应生成的类胡萝卜素的快速提取方法，属于生物工程技术领域。

发明背景

类胡萝卜素是一类食用天然色素，既是常用的着色剂，又具有多种生物活性。该类化合物为链状或环状含有8个异戊间二烯单位、四萜烯类头尾连接而成的多异戊间二烯化合物，不溶于水。类胡萝卜素作为天然色素在色素的种类、资源和色素的化学性质等方面不受制约，并且类胡萝卜素是非常强的抗氧化剂，能有效的清除氧自由基，具有一定防治疾病的作用。

随着科学技术的发展和人们对食品安全的重视，天然色素开发成为研究热点，微生物特别是光合细菌的类胡萝卜素代谢途径得到深入研究，可利用其类胡萝卜素代谢基因构建重组工程菌株，体外生产番茄红素等类胡萝卜素。由于类胡萝卜素不溶于水，体外酶反应的产物需要用有机溶剂萃取，主要用甲醇-石油醚萃取或丙酮-石油醚萃取。由于番茄红素等非极性类胡萝卜素难溶于甲醇，甲醇-石油醚萃取方法对于非极性类胡萝卜素萃取效果很差；丙酮-石油醚萃取方法则由于丙酮可溶于水和石油醚的特性，易产生乳浊液，影响类胡萝卜素的提取。另外，上述两种萃取方法第一步是将甲醇或丙酮与反应液混合于55～60℃保温15～20分钟，再加石油醚进行萃取，耗时较长，易造成产物的损失，因而迫切需要对现有方法进行改进，提高色素提取的效率。

发明内容

本发明针对现有体外酶反应生成的类胡萝卜素产物提取方法耗时长，提取量低的缺陷，提供一种快速高效的体外酶反应生成的类胡萝卜素的提取方法，即变性蛋白沉淀法，缩短产物提取的时间，减少产物损失，大幅提高产物提取量。

术语说明：

本发明中所述类胡萝卜素是指不溶于水的含有8个异戊间二烯单位头尾连接而成的色素物质，具体为链孢红素及其衍生物和番茄红素及其衍生物。

本发明的目的通过以下技术方案得以实现：

一种体外酶反应生成的类胡萝卜素的快速提取方法，步骤如下：

(1)将表达类胡萝卜素代谢相关酶的重组大肠杆菌菌体超声波破壁，制得类胡萝卜素代谢相关酶粗酶液；

(2)向步骤(1)制得的类胡萝卜素代谢相关酶粗酶液中加入相应的反应物质，反应体系用缓冲液定容后，超声波混匀，30℃避光密闭振荡反应1小时，得混合液；

(3)向步骤(2)制得的混合液中加入1/15～1/10体积2mol/L NaOH和1/15～1/10体积10％SDS溶液，混合均匀；再加入混合液1/2体积3mol/L NaAc溶液，振荡5～10秒，离心，弃上清液，得蛋白质沉淀；

(4)向步骤(3)制得的蛋白质沉淀中加入丙酮，搅拌1～2分钟，使沉淀均匀分散，得到含类胡萝卜素产物的丙酮溶液；

(5)将步骤(4)制得的含类胡萝卜素产物的丙酮溶液经离心后，取上清液，滤膜过滤后，经检测，即得类胡萝卜素的丙酮溶液。

所述步骤(1)中超声波破壁的条件为：22kHz，150W，30分钟。

所述步骤(1)中类胡萝卜素代谢相关酶为八氢番茄红素脱氢酶、羟基链孢红素合成酶、羟甲基链孢红素合成酶、球形烯加氧酶、番茄红素环化酶之一。

上述八氢番茄红素脱氢酶的反应物质为八氢番茄红素和其他除氧反应物、羟基链孢红素合成酶的反应物质为链孢红素、羟甲基链孢红素合成酶的反应物质为羟基链孢红素和其他除氧反应物、球形烯加氧酶的反应物质为球形烯、番茄红素环化酶的反应物质为番茄红素和其他除氧反应物。

优选的，上述八氢番茄红素、链孢红素、羟基链孢红素、球形烯或番茄红素的反应浓度为10μmol/L。

优选的，上述其他除氧反应物为葡萄糖、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，葡萄糖的反应浓度为2mmol/L，葡萄糖氧化酶的反应浓度为20U/mL，过氧化氢酶的反应浓度为20000U/mL；其中U为国际标准活力单位。

所述步骤(2)中超声波混匀条件为：22kHz，50～150W，10～60秒。

所述步骤(3)中离心条件为：12000rpm离心1分钟。类胡萝卜素随蛋白质共沉淀。

所述步骤(5)中离心条件为：12000rpm离心1分钟。

所述步骤(5)中的检测采用HPLC进行产物检测，色谱柱为美国Agilent公司出售的TC-C18，流动相甲醇/乙腈(体积比为4/6)，流速1mL/分钟，柱温30℃，检测波长474nm。

所述步骤(5)中的滤膜为22μm滤膜。

以上操作步骤、实验条件及试剂如无特别说明，均采用本领域常规操作和常用试剂。