[发明专利]YHV的荧光RT-PCT定量检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种YHV的荧光RT-PCT定量检测试剂盒及检测方法，包含酶或微生物的测定或检验方法及其所用的组合物或试纸领域。

背景技术

YHV是黄头病毒（Yello head virus）的英文缩写，它是一种有包膜的杆状病毒，大小为150~170 nm×40~50nm，其基因组为单正链RNA，全基因序列长度26662bp（EU487200.1），主要编码4种结构蛋白（170 kDa、135 kDa、67 kDa和22kDa）。人工感染实验证明YHV能感染大多数养殖对虾并能引起很高的死亡率，是一种严重威胁虾养殖业的病原体，它引起的虾黄头病属于国际兽疫局（International office of Epizootic Disease，OIE） 规定的必需上报的二类疫病。 1990年泰国首次发现YHV引起黑虎虾（Black tiger shrimp）大量死亡，1992年该病在泰国境内流行并导致虾减产5000 吨，随后在东南亚蔓延，最近在美洲也有发生。由于缺乏有效的防治措施，杜绝YHV流入我国境内便成为关键，因此加强对外国进口的养殖对虾的检验检疫显得十分重要。但目前我国使用的检验检疫行业标准方法（SN/T 1151.4-2003）是一种早期的普通RT-PCR技术，存在着操作复杂、步骤繁多、容易污染、检测时间长、灵敏度低、重复性差等多种缺点。

发明内容

针对上述不足，本发明所要解决的技术问题是如何简化操作步骤、缩短检测时间、提高检测灵敏度，以此为目的而建立起快速荧光RT-PCR定量检测YHV的方法，并提供YHV的荧光RT-PCT定量检测试剂盒及检测方法。

本发明提供的YHV的荧光RT-PCT定量检测试剂盒，其中有以试剂瓶包装的试剂，所包装试剂包括：

名称为荧光YHV-F的上游引物，其寡核苷酸序列是：5’-CGT CCC GGC AAT TGT GAT-3’；

名称为荧光YHV-R的下游引物，其寡核苷酸序列是：5’-GAG AGA CCA GCG GAG AAC CA-3’；

名称为荧光YHV-P的TaqMan探针，其寡核苷酸序列是：5’-FAM-CCA TCA AAG CTC TCA ACG CCG TCA C -TAMRA-3’。

本发明提供的YHV的荧光RT-PCT定量检测试剂盒，其中所包装的上、下游引物和TaqMan探针，有较强的特异性。YHV的RNA序列分析发现其基因结构与澳大利亚本土腮相关病毒(Gill-associatd virus，GAV)高度相似，但本发明设计的上游引物、下游引物、TaqMan探针与扩增产物的序列经Blast（在DNA数据库中进行相似性比较的分析工具，Basic Local Alignment Search Tool的缩写）程序比对确认与GAV的同源性分别为61.1%、75.0%、84.0%与74.7% ；而与以下来源不同的YHV标准毒株序列（FJ848674.1、FJ848673.1、EU977578.1、EU487200.1、EF648276.1、DQ978356.1、AF148846.1）的同源性均为完全一致。因此本发明设计的引物和探针能与来源不同的YHV发生特异性反应而与GAV则基本不可能发生非特异性反应。与现有技术《对虾黄头病毒(YHV)逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法，中华人民共和国出入境检验检疫行业标准（SN/T 1151.4-2003）》相比，本发明试剂盒在应用中有检测快速、实时定量、灵敏度高、特异性强、重复性好、操作简单、不易污染等特点。

所说试剂盒中的各试剂浓度为反应浓度的倍数，各试剂的反应浓度是：

上游引物，荧光YHV-F  20 μM；

下游引物，荧光YHV-R  20 μM；

TaqMan探针，荧光YHV-P  10 μM。

所说试剂盒中的各试剂量为反应浓度下的反应量的倍数，各试剂的反应量：

浓度为20 μM的上游引物，荧光YHV-F   0.4 μl；

浓度为20 μM的下游引物，荧光YHV-R   0.4 μl；

浓度为10 μM的TaqMan探针，荧光YHV-P   0.4 μl 。

本发明提供的YHV的荧光RT-PCT定量检测试剂盒，还包括以下试剂：

TaKaRa公司生产的2×One step RT-PCR Buffer Ⅲ；

TaKaRa公司生产的Ex Taq HS酶；