[发明专利]YHV的荧光RT-PCT定量检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种YHV的荧光RT-PCT定量检测试剂盒，其特征是其中有以试剂瓶包装的试剂，所包装试剂包括：

上游引物，其寡核苷酸序列是：5’-CGT CCC GGC AAT TGT GAT-3’；

下游引物，其寡核苷酸序列是：5’-GAG AGA CCA GCG GAG AAC CA-3’；

TaqMan探针，其寡核苷酸序列是：5’-FAM-CCA TCA AAG CTC TCA ACG CCG TCA C -TAMRA-3’。

2.如权利要求1所述的YHV的荧光RT-PCT定量检测试剂盒，其特征是所说试剂盒中的各试剂浓度为反应浓度的倍数，各试剂的反应浓度是：

上游引物  20 μM；

下游引物  20 μM；

TaqMan探针  10 μM。

3.如权利要求1所述的YHV的荧光RT-PCT定量检测试剂盒，其特征是所说试剂盒中的各试剂量为反应浓度下的反应量的倍数，各试剂的反应量：

浓度为20 μM的上游引物   0.4 μl；

浓度为20 μM的下游引物   0.4 μl；

浓度为10 μM的TaqMan探针   0.4 μl 。

4.如权利要求1或2或3所述的YHV的荧光RT-PCT定量检测试剂盒，其特征是还包括以下试剂：

TaKaRa公司生产的2×One step RT-PCR Buffer Ⅲ；

TaKaRa公司生产的Ex Taq HS酶；

TaKaRa公司生产的PrimeScript RT Enzyme MixⅡ反转录酶混合物。

5.如权利要求4所述的YHV的荧光RT-PCT定量检测试剂盒，其特征是所说试剂的包装量是一个试验反应量的倍数，各试剂的反应量是：

2×One step RT-PCR Buffer Ⅲ 10μl；

5U/μl Ex Taq HS酶0.4μl；

RT Enzyme MixⅡ 0.4μl。

6.如权利要求5所述的YHV的荧光RT-PCT定量检测试剂盒，其特征是还包括无RNase去离子水，其包装量是一个反应量6.0 μl的倍数。

7.如权利要求3或5或6所述的YHV的荧光RT-PCT定量检测试剂盒，其特征是各试剂的包装量与反应量的倍数相等。

8.一种YHV的荧光RT-PCT定量检测方法，先配制反应液，再进行扩增反应，最后由仪器自动计算结果并输出定量数据；扩增反应所需要试管总数n与所要反应的模板数相同，模板数包括受检样本模板个数外、1个阴性对照模板、1个阳性对照模板、4~6个定量标准模板，则反应液配制量是反应所需要试管总数的用量与1管余量的和；其特征是所说的配制方法是在1.5ml无菌EP管中依次加入下列试剂的n+1倍：2×One step RT-PCR BufferⅢ 10μl、TaKaRa Ex Taq 0.4μl、PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.4μl、20 μM 上游引物0.4 μl、20 μM 下游引物0.4 μl、10 μM TaqMan 探针0.4 μl、无RNase去离子水6.0 μl，混匀后以每管18μl分装在n个玻璃毛细反应管中；所说上游引物的寡核苷酸序列是：5’-CGT CCC GGC AAT TGT GAT-3’；下游引物的寡核苷酸序列是：5’-GAG AGA CCA GCG GAG AAC CA-3’；TaqMan探针的寡核苷酸序列是：5’-FAM-CCA TCA AAG CTC TCA ACG CCG TCA C -TAMRA-3’；在进行扩增反应前在每个玻璃毛细反应管中加入2.0 μl模板，使反应总体积为20 μl，其中1个反应管中加阴性对照模板、1个反应管中加阳性对照模板、4~6个反应管中加定量标准模板，其余反应管中加受检样本模板；然后将所有扩增反应玻璃毛细管低速离心1分钟，离心后的玻璃毛细管移入实时荧光PCT仪器中作扩增反应；所说扩增反应的条件是以反转录42℃ 5min→预变性95℃ 10s→变性95℃ 5s→退火延伸60℃ 20s为一个周期，共进行循环40个周期；其中温度变化速率为20℃/s；在每个周期中延伸结束时收集荧光信号，仪器收集方式设为“SINGLE”，即单点收集；仪器检测通道选择“F1”，即荧光发光基团FAM的通道选择吸收波长在485~530nm的荧光。