[发明专利]尿毒症长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型及其构建方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种尿毒症核糖核酸差异性表达模型，尤其涉及一种尿毒症外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型及其构建方法。

【背景技术】

尿毒症是指急性或慢性肾功能不全发展到严重阶段时机体出现的一系列自体中毒的症状。尿毒症一般与遗传因素和环境因素相关，但这些因素并不能完全阐明尿毒症发生的机制。由急性肾损伤引起的炎性细胞因子，可能导致肾脏疾病的发生。一些研究发现铁，铁蛋白，C反应蛋白(CRP)，肿瘤坏死因子(INF)，白细胞介素10(IL-10)和白细胞介素6(IL-6)等与尿毒症有关。在无肾实质损害的情况下，寻找影响尿毒症的潜在的细胞因子mRNAs。目前研究发现，尿毒症环境抑制HK-2细胞促炎性细胞因子mRNAs水平，同时影响microRNA的表达水平。有可能参与基因转录的改变和转录后修饰，基因转录的改变如聚合酶II招募，转录后修饰如由microRNA诱导等。研究人员已经从DNA，mRNA以及蛋白质等方面对尿毒症进行研究，希望通过此来阐明尿毒症机制，以便找到理想的生物标志物，有利于尿毒症的早期诊断和预防，但离成功仍有一定的距离。

目前主要依靠维持透析和肾移植等替代治疗尿毒症，但是尿毒症患者心血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)的发生率和死亡率在持续增加，是患者在治疗时需要关切的问题。至今为止，对于尿毒症发病机制的研究仍有许多争议，目前临床上仍以水溶性小分子物质作为尿毒症判定及肾脏替代治疗疗效的指标，但尿毒症患者的预后水平不佳，即预测疾病的可能病程和结局不准确。因此为使尿毒症患者的临床管理得到改善，目前仍缺乏一个快速，有效，可靠的生物标记物来监测疾病的发生与发展。

核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)中的长链非编码RNA(long non-codingRNA，lncRNA)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，它们并不编码蛋白，起初被认为是基因转录的“噪音”。近年来的研究发现，lncRNA具有重要的生物学功能，可以同时上调或下调真核生物和原核生物中的基因表达，参与了基因组印记，X染色体沉默，应激反应等多种重要的调控过程。此外，近来有关胚胎干细胞，成人大脑，CD8+T细胞和其他一些疾病的全基因组的研究表明，lncRNA功能多样化并在特定细胞类型中表达或位于特定亚细胞层。

但是，如何结合lncRNA方法对尿毒症进行综合分析，目前尚未有具体的研究结果和技术信息。

因此，现有技术需要改进。

【发明内容】

有鉴于此，有必要提出一种尿毒症外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型及其构建方法。

本发明的一个技术方案是，一种尿毒症外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型的构建方法，其包括以下步骤：A1、获取尿毒症患者组与正常对照组的离体的测试外周血样本，对各所述测试外周血样本，分别获取基因芯片数据；A2、将各所述测试外周血样本的基因芯片数据上传到基因芯片数据分析软件，并设置归一化基准以及数据滤过的比值倍数，获取差异表达基因，得到尿毒症外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型。

其中，应用于上述方案，所述步骤A1中，获取基因芯片数据具体执行以下步骤：A11、采用生理盐水对倍稀释全血，缓慢叠加于等体积的淋巴细胞缓冲液；A12、以800×g水平离心30分钟后，吸取单个核细胞，用生理盐水清洗两次，用枪头吸除管底沉淀细胞上的液体，加入1mL总RNA提取试剂吹打混匀后置于零下80℃冰箱保存；A13、采用总RNA提取试剂抽提RNA，通过硅胶膜纯化法获得纯化的RNA；A14、使用超微量核酸蛋白测定仪分别测定RNA在230nm、260nm、280nm波长下的吸收值，计算RNA浓度以评估RNA纯度，并使用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性；A15、使用双链互补DNA合成试剂盒，将获得的RNA合成双链互补DNA，使用单色DNA标记试剂盒进行标记；A16、使用芯片杂交系统对标记后的双链互补DNA进行排列杂交，得到杂交芯片，采用匹配的清洗试剂盒清洗杂交芯片；A17、使用芯片扫描仪扫描清洗后的杂交芯片的荧光强度，使用635nm激发，获得芯片扫描图像后，使用生物芯片扫描分析软件进行数据分析，导出格式化微阵列文本数据作为所述基因芯片数据。

应用于上述各方案，所述的构建方法中，所述步骤A1中，获取尿毒症患者组与正常对照组的离体的测试外周血样本，执行以下步骤A10：用肝素钠管获取已经脱离人体的外周血5mL作为所述测试外周血样本。