[发明专利]尿毒症长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型及其构建方法

权利要求书

1.一种尿毒症外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

A1、获取尿毒症患者组与正常对照组的离体的测试外周血样本，对各所述测试外周血样本，分别获取基因芯片数据，具体执行以下步骤：

A11、采用生理盐水对倍稀释全血，再缓慢加入至等体积的淋巴细胞缓冲液；

A12、以800×g水平离心30分钟后，吸取单个核细胞，用生理盐水清洗两次，吸除管底沉淀细胞上的液体，加入1mL总RNA提取试剂吹打混匀后置于零下80摄氏度保存；

A13、采用总RNA提取试剂抽提RNA，通过硅胶膜纯化法获得纯化的RNA；

A14、使用超微量核酸蛋白测定仪分别测定RNA在230nm、260nm、280nm波长下的吸收值，计算RNA浓度以评估RNA纯度，并使用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性；

A15、使用双链互补DNA合成试剂盒，将获得的RNA合成双链互补DNA，使用单色DNA标记试剂盒进行标记；

A16、使用芯片杂交系统对标记后的双链互补DNA进行排列杂交，得到杂交芯片，采用匹配的清洗试剂盒清洗杂交芯片；

A17、使用芯片扫描仪扫描清洗后的杂交芯片的荧光强度，使用635nm激发，获得芯片扫描图像后，使用生物芯片扫描分析软件进行数据分析，导出格式化微阵列文本数据作为所述基因芯片数据；

A2、将各所述测试外周血样本的基因芯片数据上传到基因芯片数据分析软件，并设置归一化基准以及数据滤过的比值倍数，获取差异表达基因，得到尿毒症外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A1中，获取尿毒症患者组与正常对照组的离体的测试外周血样本，执行以下步骤A10：用肝素钠管获取已经脱离人体的外周血5mL作为所述测试外周血样本。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A2之后，执行以下步骤A3：挑选若干个差异表达的长链非编码RNA进行实时定量PCR的相对定量测试，其中，采用PCR引物设计软件设计引物，实时定量PCR时各样品加样量均为2μL，并使用β肌动蛋白作为内参，95摄氏度预变性10分钟后，进行40个PCR循环，其中，95摄氏度变性15秒，60摄氏度退火60秒并收集荧光数据；扩增反应后，按95摄氏度变性15秒，60摄氏度退火20秒，从60摄氏度缓慢加热到99摄氏度熔解15秒，建立PCR产物的熔解曲线；

其中，执行PCR热循环文件时的加热/冷却速度为2％。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，采用2-ΔΔCT法进行分析实时定量PCR的相对定量测试结果。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A13中，所述硅胶膜纯化法采用Qiagen公司的RNeasy试剂盒完成。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A15中，采用分光光度计检测荧光标记效率。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A17中，所述芯片扫描图像按TIF图像格式进行存储，所述基因芯片数据按Excel文件格式进行存储；并且，采用数据原始值减去扫描仪的背景值得到修正值，然后采用中值标准化方法对得到的修正值进行标准化，得到标准值数据，使用基因芯片数据分析软件对标准值数据进行数据分析。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A2中，设置所述比值倍数大于2，并且，所述分析结果按Excel文件格式进行存储。

9.一种尿毒症外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型，其特征在于，其采用如权利要求1至8任一所述的构建方法构建获得。

10.根据权利要求9所述的尿毒症外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型，其特征在于，所述尿毒症外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型包括以下6个长链非编码RNA，分别为：uc001boe，uc002flc，uc003obo，AY555145，BC041951以及U79273。