[发明专利]一种农杆菌介导法获得转基因黄瓜植株的方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种农杆菌介导法获得转基因黄瓜植株的方法，是利用农杆菌介导法将目的基因构建到植物表达载体pBI121上，然后转化根癌农杆菌LBA4404，侵染黄瓜，进而得到转基因黄瓜植株，属于农业高新技术领域。

（二）背景技术

目前，应用较广泛的转基因技术有农杆菌介导法、花粉通道法、显微注射法、基因枪法、离子束介导法等等，其中农杆菌介导法以其费用低、拷贝数低、重复性好、基因沉默现象少、转育周期短及能转化较大片段等独特优点而备受科学工作者的青睐。

农杆菌介导法主要以植物的分生组织和生殖器官作为外源基因导入的受体，通过真空渗透法、浸蘸法及注射法等方法使农杆菌与受体材料接触，以完成可遗传细胞的转化，然后利用组织培养的方法培育出转基因植株，并通过抗生素筛选和分子检测鉴定转基因植株后代。

黄瓜高效再生体系是实现农杆菌介导基因转化的基础，但当前黄瓜再生体系并不成熟，植物组织培养在黄瓜育种中的应用远没有在花卉、果树等园艺植物中那么广泛。对黄瓜组织培养的研究主要集中在外植体种类、苗龄、接种方式等方面，已经建立的再生体系存在再生频率低、再生周期长、遗传稳定差的缺点，严重影响了黄瓜遗传转化体系的建立。

本发明的目的是在建立一套完整高效的黄瓜再生体系基础上，进而建立高转化率的农杆菌介导法黄瓜遗传转化体系，获得转基因黄瓜植株，为创建黄瓜新种质提供新途径。

（三）发明内容  

为了解决目前现有技术存在的黄瓜中基因转化率低的问题，建立高转化率的农杆菌介导法黄瓜遗传转化体系，获得转基因黄瓜植株，本发明提供了一种农杆菌介导法获得转基因黄瓜植株的方法，包括以下步骤：

1）选取6~7 d苗龄、两片子叶张开呈竖直状态的无菌黄瓜幼苗，切取连带下胚轴2 mm子叶，去除生长点，从下胚轴处纵切为二，切除子叶末端1/3部分，并切除叶缘得到外植体子叶节；将子叶节平铺于分化培养基[MS + 1.5~1.7 mg·L^-1 6-苄基腺膘呤（6-BA）] 上置于黑暗中进行预培养2 d；

2）把经过预培养的子叶节浸没在农杆菌悬浮液中 15~20 min；侵染结束后用无菌纸吸干子叶节表面残留的菌液，将子叶节置于分化培养基（MS + 1.5~1.7 mg·L^-1 6-BA）上于黑暗中进行共培养2~3 d；

3）共培养结束后，用含有250 mg·L^-1羧苄青霉素（Cb）的液体 MS 培养基洗净子叶节表面农杆菌，用无菌纸吸干子叶节表面的液体；

4）将上述处理好的子叶节接种到分化及选择培养基（MS + 1.5~1.7 mg·L^-1 BA  +100~150 mg·L^-1 Kan + 250 mg·L^-1 Cb）上进行芽诱导培养不定芽；待不定芽长至1.5~2 cm 高时，将其从子叶节基部切下，接种到生根培养基（MS + 50mg·L^-1 Kan）上进行生根培养。当不定芽基部产生大量须根，逐步开启封口膜，炼苗一周后移栽入土。

缓苗后，长出2~3片新叶时，提取所得黄瓜幼苗新叶的DNA和RNA，进行PCR鉴定，再通过RT-PCR 检测所得株系的表达情况，进一步确定获得转基因黄瓜植株。鉴定结果表明使用本发明转化方法所得转基因黄瓜幼苗植株转化率高达4.8%。

 

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

1.   外植体易得：本发明所用外植体为黄瓜无菌苗子叶节，材料易得。

2. 再生频率高：本发明条件下，以子叶节为外植体，其再生频率高达94.3%；上胚轴再生频率为 21 %；而下胚轴、子叶、真叶不能产生不定芽。

3. 转化体系步骤简单：本发明条件下，经过预培养、侵染及共培养、选择及分化培养、生根培养等步骤，不必经过启动培养、芽伸长培养等步骤，简化了程序，操作简单。

4. 转化效率高：本发明条件下，使用150 mg·L^-1Kan（卡那霉素）进行转基因株系筛选，所得转基因黄瓜幼苗植株转化率高达4.8%。

（四）附图说明

图1为外植体子叶节获得流程图