[发明专利]一种构建T载体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体的说是涉及一种构建T载体的方法。

背景技术

基因克隆技术是现代基因工程研究的一项基本技术，是研究基因结构与功能的前提，利用T载体进行基因克隆是其中一种最简捷、方便的方法。T载体是聚合酶链反应产物的克隆用载体，线性化后两侧3′端各多出一个脱氧胸苷酸(T)。

在利用Taq DNA聚合酶对基因进行PCR扩增时，PCR产物的3′末端会多加上一个脱氧腺苷酸(A)碱基，可与T载体的3′末端突出的T碱基配对，在DNA连接酶的作用下形成闭合环状分子，然后转化入大肠杆菌感受细胞，培养长成克隆菌落。利用菌落PCR和抽提质粒后限制性酶切的方法来初步筛选阳性克隆，最后通过测序来鉴定克隆到的基因片段是否是目的基因片段。PCR产物与T载体之间的A-T互补性可提高PCR产物克隆的效率，因此T载体在基因克隆方面应用非常广泛。

目前T载体售价大多偏高，而且存在连接效率低、连接不稳定等缺陷。因此制备高质量、稳定、价廉的T载体是广大分子生物学研究者关心的问题，也是生物试剂厂商感兴趣的业务之一。

目前T载体的构建方法主要是用产生平末端的限制性内切酶(如EcoRV)将质粒DNA切开，利用Taq DNA聚合酶和ddTTP在线性质粒两条链的3′端加T制成T载体，如Takara的pMD系列T载体和Promega的pGEM系列T载体。但该方法存在两方面的缺陷：一是线性质粒3′末端在DNA聚合酶作用下加T可能不完全，造成克隆过程中自身环化率高，假阳性率较高；二是该方法需要经过EcoRV酶切、DNA聚合酶加T、电泳凝胶回收DNA片段等多个步骤，需要进行质量控制的环节较多，影响T载体克隆效率的因素也很多，T载体质量较低。同时由于T载体的生产过程繁琐，成本较高，最终导致商业化T载体的价格较高。

发明内容

有鉴于此，本发明目的是提供一种简便高效构建T载体的方法，利用该方法可获得高质量、高稳定性的T载体，其克隆效率和正确率高。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种构建T载体的方法，包括：

步骤1、将两端含有特异限制性内切酶识别序列的抗性基因定向克隆到出发载体的两个多克隆位点之间，用上述抗性基因对应的抗生素筛选阳性克隆，得到T载体前体；

步骤2、用步骤1所述特异限制性内切酶识别序列对应的特异限制性内切酶消化步骤1所得T载体前体，回收大片段，得到T载体；

其中，所述特异限制性内切酶为其识别序列被酶切后突出末端位点可以是T的限制性内切酶，步骤1所述抗性基因与出发载体所含抗性基因不同。

本发明所述构建T载体的方法是利用限制性酶切法原理，将两端含有特异限制性内切酶识别序列的抗性基因定向克隆到出发载体上，在出发载体质粒的多克隆位点引入酶切后突出末端位点可以是T的限制性内切酶酶切位点和与出发载体所含抗性基因不同的抗性基因的片段，用上述抗性基因对应的抗生素筛选阳性克隆，得到T载体前体，然后用特异限制性内切酶识别序列对应的特异限制性内切酶酶切消化产生3′端具有单个突出T的线性T载体。

由限制性内切酶酶切产生的T载体具有酶切产量高、质量稳定、易于操作等特点，然而由于定向克隆到出发载体中经常会发生出发载体环化现象，造成假阳性。为了提高克隆效率，减少假阳性，需要把阳性克隆从部分假阳性中分离出来。本发明在构建T载体前体质粒时引入与出发载体所含抗性基因不同的抗性基因进行筛选，以便能很容易区分阳性克隆，方法简便高效，可操作性高。

优选的，本发明所述构建T载体的方法，步骤1具体包括：

步骤1a、以含有抗性基因的载体为模板，利用上游引物和下游引物扩增抗性基因片段，回收抗性基因片段备用，其中，所述上游引物和下游引物均含有一个特异限制性内切酶识别序列和一个出发载体中具有的限制性内切酶的识别序列，限制性内切酶的识别序列位于特异限制性内切酶识别序列的5′端，且上游引物和下游引物含有的限制性内切酶的识别序列不同；

步骤1b、分别利用识别步骤1a所述限制性内切酶识别序列的限制性内切酶消化出发载体和步骤1a所得抗性基因片段；

步骤1c：回收线性化出发载体和消化后抗性基因片段，混合，在T4 DNA连接酶作用下连接，用上述抗性基因对应的抗生素筛选阳性克隆，得到T载体前体。