[发明专利]一种构建T载体的方法

权利要求书

1.一种构建T载体的方法，其特征在于，包括：

步骤1、将两端含有特异限制性内切酶识别序列的抗性基因定向克隆到出发载体的两个多克隆位点之间，用上述抗性基因对应的抗生素筛选阳性克隆，得到T载体前体；

步骤2、用步骤1所述特异限制性内切酶识别序列对应的特异限制性内切酶消化步骤1所得T载体前体，回收大片段，得到T载体；

其中，所述特异限制性内切酶为其识别序列被酶切后突出末端位点可以是T的限制性内切酶，步骤1所述抗性基因与出发载体所含抗性基因不同。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1具体包括：

步骤1a、以含有抗性基因的载体为模板，利用上游引物和下游引物扩增抗性基因片段，回收抗性基因片段备用，其中，所述上游引物和下游引物均含有一个特异限制性内切酶识别序列和一个出发载体中具有的限制性内切酶的识别序列，限制性内切酶的识别序列位于特异限制性内切酶识别序列的5′端，且上游引物和下游引物含有的限制性内切酶的识别序列不同；

步骤1b、分别利用识别步骤1a所述限制性内切酶识别序列的限制性内切酶消化出发载体和步骤1a所得抗性基因片段；

步骤1c：回收线性化消化后出发载体和抗性基因片段，混合，在T4 DNA连接酶作用下连接，用上述抗性基因对应的抗生素筛选阳性克隆，得到T载体前体。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述特异限制性内切酶为AhdI、BmrI、HPyAV、MnlI、BciVI、HphI、MboII、XcmI、Bst4CI、TaaI、Tsp4CI、AspEI、BmeRI、Hpy188I或HpyCH4III。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述出发载体为pUC18或pUC19。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述抗性基因为具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的卡那霉素抗性基因。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤1a所述含有抗性基因的载体为pEGFP-C1载体。

7.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1a所述上游引物含有的限制性内切酶识别序列为BamHI的识别序列，下游引物含有的限制性内切酶识别序列为HindIII的识别序列。

8.根据权利要求2所述方法，其特征在于，在步骤1a所述限制性内切酶的识别序列5′端还分别含有1～6个碱基的保护序列。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，步骤1a所述上游引物为SEQ ID NO：2所示核苷酸序列，步骤1a所述下游引物为SEQ ID NO：3所示核苷酸序列。

10.权利要求1～9任意一项所述方法制备的T载体。