[发明专利]红球菌及用于腈水解合成苯乙酮酸的方法

说明书

技术领域

本发明公开了土壤中分离的腈水解酶产生菌Rhodococcus sp. CCZU10-1及其用于催化甲酰甲腈水解制备苯乙酮酸的方法，属于微生物技术领域。

背景技术

苯乙酮酸是一种重要的有机合成中间体，广泛地用于农药和医药等合成。随着其市场的不断扩展，对苯乙酮酸的需求不断增加，应用范围也逐渐拓宽。目前，国内外已报道了很多苯乙酮酸的生产方法，其中化学合成法主要是：(1)苯甲酰腈水解法，(2)扁桃酸氧化法，(3)傅克酰化法和(4)苯乙烯氧化法。上述各种化学方法已取得了较好的效果，但同时也有一些不足之处，例如，产物中都含有杂质，并且化学合成法通常存在产品收率低、成本高和环境污染严重等缺点，与之相比，由于利用生物法实现苯乙酮酸的合成具有反应条件温和，产品收率高等优点，符合绿色化学的发展要求，而越来越受到国内外学者的青睐。生物法中涉及腈水解的酶系主要有腈水解酶、腈水合酶和酰胺酶；腈水解酶能将腈水解生成相应的羧酸和氨，具有选择性好、反应条件温和及产品纯度高等优点，明显优于化学法水解。然而，少有报道利用苯甲酰甲腈水解酶催化合成苯乙酮酸，筛选新的苯甲酰甲腈水解酶菌株成为当务之急。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是公开一种红球菌的培养及用于腈水解制备苯乙酮酸的方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明所述的红球菌Rhodococcus sp. CCZU10-1，该菌株已于2011年5月25日保藏在位于中国北京的北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 4911。

上述红球菌Rhodococcus sp. CCZU10-1，CGMCC No. 4911，用于催化苯甲酰甲腈生产苯乙酮酸的方法，按照下述步骤进行：

一、菌株的培养：

（1）种子液的摇瓶培养：将所说的红球菌Rhodococcus sp. CCZU10-1，CGMCC No. 4911，采用本领域常规的方法，在种子液培养基中进行扩增培养在20~40 ℃下100~160 rpm的摇床上培养12~36 h，离心、洗涤得到静息细胞；

（2）发酵罐扩大培养：在5 L发酵罐中加入适量占发酵罐体积50-70%的发酵培养基，接种量占发酵培养基体积的1~10%, 接种至5 L发酵罐中，通气量1:0.1~1:1 (v/v/m)，搅拌转速200~450 rpm，温度20~40 °C，时间15~72 h，离心、洗涤得到静息细胞；

二、静息细胞催化苯甲酰甲腈水解生产苯乙酮酸：

将收获的静息细胞，以1~100 g湿重/L悬浮于pH为6.0~8.0的体积比为98%:2%-90%:10%的磷酸钾缓冲溶液-有机溶剂两相体系中，加入苯甲酰甲腈，使其浓度为10~1000 mM，在20~40 °C和100~160 rpm的恒温摇床上振荡反应2~120 h后，离心除去细胞，利用2 M NaOH溶液调pH至8.5，利用等体积的乙酸乙酯萃取3次，保留水相，然后利用6 M HCl的溶液调pH至1.0，利用等体积的乙醚萃取3次，收集有机相，经无水Na₂SO₄干燥过夜后减压蒸去溶剂，即得粗产品，然后过硅胶柱纯化，洗脱液为体积比为25:5:1的苯/乙酸乙酯/甲酸溶液，收集的苯乙酮酸溶液通过旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到黄色苯乙酮酸粉末。

其中所述的步骤二也可以采用下述技术方案：海藻酸钙固定化细胞催化苯甲酰甲腈水解生产苯乙酮酸：

将收获的静息细胞采用海藻酸钙进行固定化，将海藻酸钙固定化细胞，以1~200 g湿重/L悬浮于pH为7.0~9.0的体积比为98%:2%-90%:10%Tris-HCl缓冲溶液-有机溶剂两相体系中，加入苯甲酰甲腈，使其浓度为10~1000 mM，在20~40 °C和100~160 rpm的恒温摇床上振荡反应2~24 h后，离心除去细胞，利用2 M NaOH溶液调pH至8.5，利用等体积的乙酸乙酯萃取3次，保留水相，然后利用6 M HCl的溶液调pH至1.0，利用等体积的乙醚萃取3次，收集有机相，经无水Na₂SO₄干燥过夜后减压蒸去溶剂，即得粗产品，然后过硅胶柱纯化，洗脱液为体积比为25:5:1的苯/乙酸乙酯/甲酸溶液，收集的苯乙酮酸溶液通过旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到黄色苯乙酮酸粉末。