[发明专利]红球菌及用于腈水解合成苯乙酮酸的方法

权利要求书

1.红球菌Rhodococcus sp. CCZU10-1，其保藏号为CGMCC No. 4911。

2.权利要求1所述的红球菌Rhodococcus sp. CCZU10-1，CGMCC No. 4911，用于催化苯甲酰甲腈生产苯乙酮酸的方法，其特征在于按照下述步骤进行：

一、菌株的培养：

（1）种子液的摇瓶培养：将所说的红球菌Rhodococcus sp. CCZU10-1，CGMCC No. 4911，采用本领域常规的方法，在种子液培养基中进行扩增培养在20~40 ℃下100~160 rpm的摇床上培养12~36 h，离心、洗涤得到静息细胞；

（2）发酵罐扩大培养：在5 L发酵罐中加入适量占发酵罐体积50-70%的发酵培养基，接种量占发酵培养基体积的1~10%, 接种至5 L发酵罐中，通气量1:0.1~1:1 (v/v/m)，搅拌转速200~450 rpm，温度20~40 °C，时间15~72 h，离心、洗涤得到静息细胞；

二、静息细胞催化苯甲酰甲腈水解生产苯乙酮酸：

将收获的静息细胞，以1~100 g湿重/L悬浮于pH为6.0~8.0的体积比为98%:2%-90%:10%的磷酸钾缓冲溶液-有机溶剂两相体系中，加入苯甲酰甲腈，使其浓度为10~1000 mM，在20~40 °C和100~160 rpm的恒温摇床上振荡反应2~120 h后，离心除去细胞，利用2 M NaOH溶液调pH至8.5，利用等体积的乙酸乙酯萃取3次，保留水相，然后利用6 M HCl的溶液调pH至1.0，利用等体积的乙醚萃取3次，收集有机相，经无水Na₂SO₄干燥过夜后减压蒸去溶剂，即得粗产品，然后过硅胶柱纯化，洗脱液为体积比为25:5:1的苯/乙酸乙酯/甲酸溶液，收集的苯乙酮酸溶液通过旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到黄色苯乙酮酸粉末。

3.权利要求2所述的红球菌Rhodococcus sp. CCZU10-1，CGMCC No. 4911，用于催化苯甲酰甲腈生产苯乙酮酸的方法，其特征在于其中所述的步骤二采用下述技术方案：海藻酸钙固定化细胞催化苯甲酰甲腈水解生产苯乙酮酸：

将收获的静息细胞采用海藻酸钙进行固定化，将海藻酸钙固定化细胞，以1~200 g湿重/L悬浮于pH为7.0~9.0的体积比为98%:2%-90%:10%Tris-HCl缓冲溶液-有机溶剂两相体系中，加入苯甲酰甲腈，使其浓度为10~1000 mM，在20~40 °C和100~160 rpm的恒温摇床上振荡反应2~24 h后，离心除去细胞，利用2 M NaOH溶液调pH至8.5，利用等体积的乙酸乙酯萃取3次，保留水相，然后利用6 M HCl的溶液调pH至1.0，利用等体积的乙醚萃取3次，收集有机相，经无水Na₂SO₄干燥过夜后减压蒸去溶剂，即得粗产品，然后过硅胶柱纯化，洗脱液为体积比为25:5:1的苯/乙酸乙酯/甲酸溶液，收集的苯乙酮酸溶液通过旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到黄色苯乙酮酸粉末。